中華鱉il6的cDNA克隆及其在急性低溫脅迫和細(xì)菌免疫應(yīng)答中的表達(dá)變化情況.pdf

1、為了研究低溫脅迫對(duì)中華鱉（Pelodiscus sinensis）早期炎性因子IL6腸道表達(dá)的影響，本論文首先細(xì)致劃分了中華鱉的腸道。采用形態(tài)學(xué)觀察、組織切片的方式研究了中華鱉的九段腸道。使用已經(jīng)在哺乳動(dòng)物和魚類的腸道中報(bào)道的9個(gè)基因，從功能上區(qū)分中華鱉腸道各區(qū)段。其次，為研究腸道部分的免疫功能，聚焦于免疫因子il6，在克隆了中華鱉il6的cDNA全長后，從啟動(dòng)子、基因結(jié)構(gòu)、共線性關(guān)系、相似性分析、系統(tǒng)發(fā)育和蛋白結(jié)構(gòu)等方面對(duì)其進(jìn)行生物信

2、息學(xué)分析；采用 qPCR手段進(jìn)行了組織表達(dá)模式分析。最后，為了探究il6免疫功能，利用免疫刺激劑（LPS、Con A和PolyI:C）在體外刺激脾臟原代細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)；為了探究低溫脅迫對(duì)il6的影響，我們采用兩個(gè)溫度（25℃，15℃）、兩種細(xì)菌（革蘭氏陰性與陽性菌）體內(nèi)攻毒的方式從5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（6h，12h，24h，72h和7d）來檢測(cè)il6在腸道以及脾臟中的表達(dá)變化情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.傳統(tǒng)手段與分子生物學(xué)方法相結(jié)

3、合對(duì)中華鱉腸道的劃分
　　根據(jù)標(biāo)記分子在各區(qū)段的表達(dá)情況，對(duì)比形態(tài)學(xué)、組織學(xué)觀察分析得到，從S1到 S3（從腸道起始占總長度的29.9％的位置，29.9％）的區(qū)域相當(dāng)于哺乳動(dòng)物十二指腸，而S4（40.2％）到S5（65.4％）、S8（92.7％）與 S9分別相當(dāng)于哺乳動(dòng)物回腸和大腸。而對(duì)于S6（81.3％）和S7（87.3％），其功能多樣，并且取決于功能基因。它們可能是小腸和大腸之間的過渡區(qū)或者屬于大腸部分。
　　2.中華鱉

4、il6的克隆及組織表達(dá)模式分析
　　啟動(dòng)子分析顯示，il6的啟動(dòng)子含有保守的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。il6 cDNA全長為2069bp，開放閱讀框長度為663bp，而il6ns cDNA全長為2194bp，開放閱讀框長度為615bp，兩者差異僅限于信號(hào)肽位置（il6編碼信號(hào)肽的序列中插入了一段125bp的序列導(dǎo)致il6ns不編碼信號(hào)肽）。中華鱉il6與鳥類、哺乳類相比均有保守的共線性關(guān)系，且相似性一致性較高。中華鱉il6與哺乳類、魚類的

5、基因結(jié)構(gòu)類似，而中華鱉il6ns與鳥類的基因結(jié)構(gòu)相似。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角。三級(jí)結(jié)構(gòu)包含IL-6/G-CSF/MGF家族特征序列（C–X(9)–C–X(6)–G–L–X(2)–Y–X(3)–L），序列末端還具有aataaa加尾信號(hào)等。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，與鳥類首先聚類，其次是哺乳類，最后是魚類。同時(shí)，以人 IL6蛋白為模型構(gòu)建了中華鱉 IL6蛋白的3D結(jié)構(gòu)模型。組織表達(dá)模式分析結(jié)果則顯示，兩個(gè)il6在

6、體內(nèi)的分布差異較大。
　　3.低溫脅迫對(duì)中華鱉腸道免疫因子il6 mRNA表達(dá)的影響
　　il6/il6ns兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在金黃色葡萄球菌或嗜水氣單胞菌脅迫后，表達(dá)量隨時(shí)間推移整體均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，且 il6的表達(dá)受低溫脅迫的影響表現(xiàn)出“應(yīng)答延遲”和“表達(dá)增強(qiáng)”的現(xiàn)象。此外還發(fā)現(xiàn)，在受到細(xì)菌入侵后，il6的mRNA表達(dá)量對(duì)細(xì)菌的應(yīng)答反應(yīng)要強(qiáng)于 il6ns的。體外實(shí)驗(yàn)表明，脾臟細(xì)胞在 PolyI: C的刺激下6h il6/il

7、6ns表達(dá)極顯著上調(diào)（P<0.01），在24h和48h表達(dá)量迅速回落。但是，在Con A和LPS的刺激下，兩個(gè)基因在各個(gè)時(shí)刻均沒有顯著性變化。
　　綜合以上研究結(jié)果得出如下結(jié)論：
　　1.通過檢測(cè)中華鱉中一些與哺乳類以及斑馬魚同源的標(biāo)記分子，可以得到一個(gè)與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)及組織學(xué)不同的、更為精確的中華鱉腸道劃分結(jié)果。
　　2.克隆得到了兩個(gè)中華鱉的il6的cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。彌補(bǔ)了爬行類il6研究的空白