中華鱉il6的cDNA克隆及其在急性低溫脅迫和細菌免疫應答中的表達變化情況.pdf

1、為了研究低溫脅迫對中華鱉（Pelodiscus sinensis）早期炎性因子IL6腸道表達的影響，本論文首先細致劃分了中華鱉的腸道。采用形態(tài)學觀察、組織切片的方式研究了中華鱉的九段腸道。使用已經在哺乳動物和魚類的腸道中報道的9個基因，從功能上區(qū)分中華鱉腸道各區(qū)段。其次，為研究腸道部分的免疫功能，聚焦于免疫因子il6，在克隆了中華鱉il6的cDNA全長后，從啟動子、基因結構、共線性關系、相似性分析、系統(tǒng)發(fā)育和蛋白結構等方面對其進行生物信

2、息學分析；采用 qPCR手段進行了組織表達模式分析。最后，為了探究il6免疫功能，利用免疫刺激劑（LPS、Con A和PolyI:C）在體外刺激脾臟原代細胞的實驗；為了探究低溫脅迫對il6的影響，我們采用兩個溫度（25℃，15℃）、兩種細菌（革蘭氏陰性與陽性菌）體內攻毒的方式從5個時間點（6h，12h，24h，72h和7d）來檢測il6在腸道以及脾臟中的表達變化情況。
　　實驗結果如下：
　　1.傳統(tǒng)手段與分子生物學方法相結

3、合對中華鱉腸道的劃分
　　根據標記分子在各區(qū)段的表達情況，對比形態(tài)學、組織學觀察分析得到，從S1到 S3（從腸道起始占總長度的29.9％的位置，29.9％）的區(qū)域相當于哺乳動物十二指腸，而S4（40.2％）到S5（65.4％）、S8（92.7％）與 S9分別相當于哺乳動物回腸和大腸。而對于S6（81.3％）和S7（87.3％），其功能多樣，并且取決于功能基因。它們可能是小腸和大腸之間的過渡區(qū)或者屬于大腸部分。
　　2.中華鱉

4、il6的克隆及組織表達模式分析
　　啟動子分析顯示，il6的啟動子含有保守的轉錄因子結合位點。il6 cDNA全長為2069bp，開放閱讀框長度為663bp，而il6ns cDNA全長為2194bp，開放閱讀框長度為615bp，兩者差異僅限于信號肽位置（il6編碼信號肽的序列中插入了一段125bp的序列導致il6ns不編碼信號肽）。中華鱉il6與鳥類、哺乳類相比均有保守的共線性關系，且相似性一致性較高。中華鱉il6與哺乳類、魚類的

5、基因結構類似，而中華鱉il6ns與鳥類的基因結構相似。蛋白二級結構主要包括α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲、β-轉角。三級結構包含IL-6/G-CSF/MGF家族特征序列（C–X(9)–C–X(6)–G–L–X(2)–Y–X(3)–L），序列末端還具有aataaa加尾信號等。系統(tǒng)進化分析顯示，與鳥類首先聚類，其次是哺乳類，最后是魚類。同時，以人 IL6蛋白為模型構建了中華鱉 IL6蛋白的3D結構模型。組織表達模式分析結果則顯示，兩個il6在

6、體內的分布差異較大。
　　3.低溫脅迫對中華鱉腸道免疫因子il6 mRNA表達的影響
　　il6/il6ns兩個轉錄本在金黃色葡萄球菌或嗜水氣單胞菌脅迫后，表達量隨時間推移整體均呈現先升后降的趨勢，且 il6的表達受低溫脅迫的影響表現出“應答延遲”和“表達增強”的現象。此外還發(fā)現，在受到細菌入侵后，il6的mRNA表達量對細菌的應答反應要強于 il6ns的。體外實驗表明，脾臟細胞在 PolyI: C的刺激下6h il6/il

7、6ns表達極顯著上調（P<0.01），在24h和48h表達量迅速回落。但是，在Con A和LPS的刺激下，兩個基因在各個時刻均沒有顯著性變化。
　　綜合以上研究結果得出如下結論：
　　1.通過檢測中華鱉中一些與哺乳類以及斑馬魚同源的標記分子，可以得到一個與傳統(tǒng)形態(tài)學及組織學不同的、更為精確的中華鱉腸道劃分結果。
　　2.克隆得到了兩個中華鱉的il6的cDNA序列，并對其進行了生物信息學分析。彌補了爬行類il6研究的空白