茯苓多糖PCP-I對(duì)炭疽保護(hù)性抗原的佐劑效應(yīng)研究.pdf

1、疫苗是經(jīng)濟(jì)有效的預(yù)防傳染病的手段，開(kāi)發(fā)安全高效的新型疫苗是疫苗學(xué)研究的目標(biāo)。亞單位疫苗和重組蛋白類(lèi)疫苗的抗原是高純度的蛋白質(zhì)，疫苗的安全性得到了提高，但是存在免疫原性弱，激發(fā)的抗體反應(yīng)不強(qiáng)，難以激發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)等不足。為了提高蛋白類(lèi)疫苗的效力，研究者們一直在尋找高效的佐劑來(lái)增強(qiáng)抗原的免疫原性，誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)或改變免疫反應(yīng)的類(lèi)型。鋁佐劑是使用最廣泛、時(shí)間最長(zhǎng)的人用疫苗佐劑。近年來(lái)，MF59、AS03、AS04和Virosomes等幾種新

2、佐劑逐漸獲批人用。而植物多糖，因其較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，以及具有生物可降解和低毒性等優(yōu)點(diǎn)，成為新型佐劑研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　茯苓多糖PCP-I是從中藥茯苓中提取純化得到的一種均一多糖，由巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成。本研究以炭疽芽孢桿菌保護(hù)性抗原（PA）為模式抗原，從體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)兩方面對(duì)PCP-I的佐劑效應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)；觀察了PCP-I與寡聚脫氧核苷酸 CpG構(gòu)成復(fù)合佐劑的佐劑效應(yīng)；分別使用炭疽致死毒素（LT）

3、攻毒模型和芽孢攻毒模型，對(duì)PCP-I增強(qiáng)PA保護(hù)效力的能力進(jìn)行了考察；從樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）成熟、生發(fā)中心（GC）反應(yīng)和外周血單核細(xì)胞（PBMC）基因表達(dá)差異三個(gè)角度，對(duì)PCP-I佐劑效應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　首先對(duì)小鼠免疫實(shí)驗(yàn)中PCP-I的量效關(guān)系進(jìn)行了考察。將0.5μg PA分別與50、200、500μg PCP-I混合，免疫BALB/c小鼠，免疫二次，間隔兩周，在二免后兩周取血檢測(cè)anti-PA抗體和抗炭疽毒素中和抗體。

4、結(jié)果表明，PCP-I為200μg時(shí)，小鼠血清中的anti-PA抗體（5.38×103）和中和抗體（8.7×101）顯著高于50μg組（1.54×102，2.65×101），略高于500μg組（4.15×103，6.13×101）。據(jù)此，選擇200μg PCP-I進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　為評(píng)價(jià)PCP-I對(duì)體液免疫的影響，以0.5μg PA分別混合PCP-I和鋁佐劑（Al），免疫BALB/c小鼠，并設(shè)PA無(wú)佐劑組和PBS組分別作為陰性和

5、空白對(duì)照，免疫三次，間隔兩周，在三免后兩周取血進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。PA+PCP-I組的anti-PA抗體滴度（1.81×104）和抗體親和力（0.81）顯著高于PA組（1.60×103，0.52），而與PA+Al組（2.35×104，0.83）相近。對(duì)anti-PA抗體亞類(lèi)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PA+PCP-I組的IgG1顯著高于IgG2a（5.12×104，2.93×103），提示PCP-I是Th2偏向型佐劑。毒素中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PA+PCP-I

6、組的中和抗體（2.55×103）顯著高于PA組（1.32×102），與PA+Al組（1.76×103）無(wú)顯著性差異。
　　為評(píng)價(jià)PCP-I對(duì)細(xì)胞免疫的影響，以5μg PA分別混合PCP-I和鋁佐劑免疫小鼠，PA無(wú)佐劑組和PBS組作對(duì)照，在三免后兩周取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫相關(guān)檢測(cè)。PA+PCP-I組小鼠脾臟中PA特異性記憶B細(xì)胞的頻率（4.26％）顯著高于PA組（0.87%），與PA+Al組（5.39%）無(wú)顯著性差異，表明PCP-I能

7、夠增強(qiáng)B細(xì)胞記憶。使用CCK8檢測(cè)脾細(xì)胞在體外接受PA刺激后的增殖情況，PA+PCP-I組小鼠脾細(xì)胞增殖指數(shù)（1.37）顯著高于PA+Al組（1.05）和PA組（1.08），表明PCP-I能提高小鼠脾細(xì)胞再次接觸抗原后的增殖能力。使用ELISPOT檢測(cè)脾細(xì)胞中IL-4、IFN-γ分泌細(xì)胞的頻率，PA+PCP-I組IL-4分泌細(xì)胞頻率（92/106）高于PA+Al組（34/106），而IFN-γ分泌細(xì)胞的頻率無(wú)明顯差異。用細(xì)胞因子芯片對(duì)P

8、A刺激培養(yǎng)的脾細(xì)胞上清中各細(xì)胞因子的含量進(jìn)行檢測(cè)，PA+PCP-I組IL-2、IL-4、IL-5的含量（63.5、23.0、1020.8pg/ml）顯著高于PA+Al組（17.0、2.6、5.1pg/ml），表明 PCP-I增強(qiáng)了記憶T細(xì)胞再次接觸抗原后分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的能力。使用炭疽致死毒素（LT）對(duì)免疫后小鼠進(jìn)行攻毒，觀察存活率。PA組和PBS組小鼠全部死亡，PA+PCP-I組小鼠存活率為75%。
　　為評(píng)價(jià)PCP-I與CpG

9、構(gòu)成的復(fù)合佐劑的佐劑效應(yīng)，使用0.5μg PA混合不同的佐劑免疫 BALB/c小鼠，在三免后兩周取血進(jìn)行檢測(cè)。PA+PCP-I+CpG組的 anti-PA抗體（1.02×105）顯著高于PA+PCP-I組（1.81×104）和PA+CpG組（3.49×103）；抗體親和力（0.73）顯著高于PA+CpG組（0.52），略低于PA+PCP-I組（0.81）。抗體亞類(lèi)分析表明，PA+PCP-I+CpG組的IgG1與PA+PCP-I組相當(dāng)（7

10、.90×104，5.12×104），而IgG2a顯著高于后者（5.12×104，2.93×103），說(shuō)明聯(lián)合佐劑使得PA特異性體液免疫反應(yīng)呈現(xiàn)Th1/Th2均衡。PA+PCP-I+CpG組的中和抗體（1.38×104）顯著高于PA+PCP-I組（2.55×103）和PA+CpG組（1.62×103）。上述結(jié)果說(shuō)明復(fù)合佐劑能夠以Th1/Th2均衡的方式提高anti-PA抗體，血清中和毒素的能力也顯著提高。使用LT對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒，觀察存活率

11、。PA+PCP-I+CpG組的存活率與PA+PCP-I組相同（75%），略高于PA+CpG組（50%）。
　　為更直接地對(duì)佐劑增強(qiáng)PA免疫保護(hù)的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，用0.5μg PA混合不同的佐劑免疫對(duì)炭疽芽孢攻擊敏感的 A/J小鼠，三免后兩周取血檢測(cè)，三免后四周使用炭疽桿菌A16R株芽孢進(jìn)行攻毒。檢測(cè)結(jié)果顯示，PA+PCP-I組的anti-PA抗體和中和抗體（7.18×103，2.42×102）低于PA+Al組（3.23×104，3.

12、49×103），而PA+PCP-I+CpG組的抗體和中和抗體（3.23×104，2.29×103）與PA+Al組相當(dāng)。芽孢攻毒后，PA+PCP-I+CpG組和PA+Al組小鼠全部存活，PA+PCP-I組小鼠存活率為83%。PCP-I單獨(dú)使用的佐劑效應(yīng)在 A/J小鼠實(shí)驗(yàn)中不如BALB/c小鼠，由于A/J小鼠屬于補(bǔ)體成分5（C5）缺陷型小鼠，推測(cè)PCP-I的佐劑效應(yīng)可能與激活補(bǔ)體途徑相關(guān)，而CpG的加入能夠在一定程度上彌補(bǔ) C5缺失對(duì)PCP

13、-I佐劑效應(yīng)的不利影響。
　　為探討PCP-I的作用機(jī)制，從DC成熟、GC反應(yīng)和PBMC基因表達(dá)差異三個(gè)角度進(jìn)行了初步研究。分別使用PA+PCP-I、PA+Al、PA刺激培養(yǎng)骨髓來(lái)源的DC，之后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面CD80和MHC-II的表達(dá)。PA+PCP-I刺激組DC中CD80陽(yáng)性細(xì)胞的比例（82.2%）顯著高于PA組（51.7%），略高于PA+Al組（65.1%）；PA+PCP-I組DC中MHC-II陽(yáng)性細(xì)胞的比例（74.

14、9%）顯著高于PA組（46.8%）和PA+Al組（56.1%）。說(shuō)明PCP-I能夠誘導(dǎo)DC上調(diào)CD80和MHC-II表達(dá)，促進(jìn)DC成熟。使用5μg PA分別混合PCP-I和鋁佐劑免疫BALB/c小鼠，免疫兩次，間隔兩周，在二免后7天取脾細(xì)胞利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GCB細(xì)胞和濾泡狀輔助T細(xì)胞（Tfh）的頻率。PA+PCP-I組小鼠脾臟中GCB細(xì)胞（7.73%）頻率顯著高于PA組（6.30%），Tfh細(xì)胞的頻率略高于后者（4.97%vs4.20

15、%），提示PCP-I能促進(jìn)生發(fā)中心反應(yīng)。使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，觀察PA+PCP-I、PA+Al和PA免疫3天后PBMC中基因表達(dá)的差異。通過(guò)數(shù)據(jù)分析，PA+PCP-I組和PA組之間比較篩選到66個(gè)差異基因，其中53個(gè)基因與PA+Al組和PA組間差異基因重疊，13個(gè)基因是PCP-I特異的差異基因。對(duì)這13個(gè)基因進(jìn)行功能注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)Il1r2、Clec4e、Stab1和C5ar1與免疫反應(yīng)相關(guān)，其中C5ar1編碼C5aR，參與補(bǔ)體C5a對(duì)特異性