Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路在砷致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及其機(jī)制研究.pdf

1、【目的】：無(wú)機(jī)砷是人類確認(rèn)致癌物，但由于砷與機(jī)體作用十分復(fù)雜，加之無(wú)機(jī)砷化合物至今尚未成功復(fù)制出致癌動(dòng)物模型，其確切的致癌機(jī)制仍未明確。目前砷致氧化應(yīng)激機(jī)制與砷致表觀遺傳改變是砷致癌機(jī)制的兩大熱點(diǎn)假說(shuō)。Keap1-Nrf2/ARE是機(jī)體最重要的抗氧化信號(hào)通路，其能夠有效地保護(hù)機(jī)體免受各類氧化損傷。然而，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該信號(hào)通路持續(xù)活化則與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性密切相關(guān)。但該信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的不同階段是如何變化及其變化機(jī)制目前尚

2、不清楚。本課題以低劑量亞砷酸鈉(NaAsO2)長(zhǎng)期染毒人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(Human keratinocyte cell, HaCaT)誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化為載體，研究ROS及Keap-Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)蛋白在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中不同階段的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而更深一步探討導(dǎo)致該信號(hào)通路表達(dá)變化可能的分子機(jī)制，為砷致癌機(jī)制研究提供新思路，同時(shí)為為癌癥的預(yù)防和治療過(guò)程中合理有效地利用和控制該通路提供新策略。
　　【方法】：1.建立低水平NaAs

3、O2長(zhǎng)期暴露誘發(fā)HaCaT細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化模型：常規(guī)培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞至貼壁并恢復(fù)形態(tài)后，換用含0.0和1.0μM NaAsO2的DMEM完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)至35代(約18周)。在該過(guò)程中不同階段(21代、28代、35代)進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及MMP-9分泌活性檢測(cè)，軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其克隆形成能力。2.低水平NaAsO2致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化不同階段(0、1、7、14、21、28、35代) Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)

4、檢測(cè)：采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平變化；生化法檢測(cè)MDA含量及SOD酶活力變化；采用Western-Blot方法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白及核漿蛋白中Nrf2、HO-1、Keap1及Bach1蛋白表達(dá)水平。3.低水平NaAsO2致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中后期(14、28、35代) Keap1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化檢測(cè)：提取相關(guān)代數(shù) HaCaT細(xì)胞基因組 DNA，采用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP

5、)檢測(cè) Keap1基因啟動(dòng)子區(qū) DNA甲基化情況。4.5-Aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-dC)處理后各指標(biāo)檢測(cè)：將正常HaCaT細(xì)胞及1.0μM NaAsO2誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化的HaCaT細(xì)胞(T-HaCaT)分別培養(yǎng)于含有0或10μM5-Aza-dC的DMEM培養(yǎng)基中5天后，采用BSP法進(jìn)行Keap1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化檢測(cè)，采用Western-Blot法檢測(cè)Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路各蛋白在總蛋白與

6、核漿蛋白中的表達(dá)變化，軟瓊脂克隆法檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力。
　　【結(jié)果】：
　　1．用1.0μM NaAsO2對(duì)HaCaT細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)染毒后發(fā)現(xiàn)：隨著染毒代數(shù)的增加，HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)速率逐漸加快，其倍增時(shí)間在35代時(shí)明顯少于傳代對(duì)照組細(xì)胞，MMP-9分泌水平在35代也明顯升高，染毒35代細(xì)胞能夠在軟瓊脂中形成明顯的克隆集落，而正常HaCaT細(xì)胞在軟瓊脂中幾乎不能生長(zhǎng)(p均<0.05)。2.對(duì)低水平NaAsO2致HaCaT細(xì)胞

7、惡性轉(zhuǎn)化不同階段ROS及Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路各相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在染毒初期(1代) HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，隨后到染毒14代其表達(dá)呈輕微下降后上升趨勢(shì)，而在14代以后隨代數(shù)增加即惡性程度增加其ROS水平逐漸降低，在35代時(shí)其活力明顯低于初代(0代) HaCaT細(xì)胞(p<0.05)。MDA含量在染毒1代時(shí)達(dá)到峰值，隨后呈緩慢下降趨勢(shì)，但與同代數(shù)傳代對(duì)照組細(xì)胞相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在染毒初期(1代)細(xì)胞內(nèi)的Nr

8、f2及HO-1表達(dá)水平和SOD酶活力水平均有所上升。隨后至暴露14代呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在砷暴露后期(21代以后) Nrf2在細(xì)胞核中持續(xù)累積，且HO-1表達(dá)水平及SOD酶活力也呈持續(xù)升高趨勢(shì)。相反的，Keap1蛋白表達(dá)水平在暴露14代以后則呈持續(xù)下降趨勢(shì)。Bach1在胞漿中的表達(dá)水平隨著染毒代數(shù)的增加逐漸升高，而總蛋白中Bach1表達(dá)水平與傳代對(duì)照組相比則無(wú)明顯變化。3.對(duì)低水平NaAsO2致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中后期Keap1基

9、因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在0.0μM NaAsO2組14、28及35代細(xì)胞中，Keap1基因啟動(dòng)子區(qū)(TSS之前，-433bp~-1bp)存在較少的甲基化CpG位點(diǎn)，其甲基化率分別為6.0±3.1％、7.1±2.8%和6.3±3.8%，相互之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而在1.0μM NaAsO2組14、28及35代細(xì)胞中，Keap1基因啟動(dòng)子區(qū)(TSS之前，-433bp~-1bp)則呈現(xiàn)明顯甲基化狀態(tài)，且隨著染毒代數(shù)的增加，其甲基化程度逐

10、漸增加，其甲基化率分別為51.1±6.5%、77.1±6.5%和90.6±4.3%，與同代數(shù)0.0μM NaAsO2組細(xì)胞相比均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，且三組之間比較也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。而在TSS之后的第一啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)(+1bp~+159bp)的16個(gè)CpG位點(diǎn)無(wú)論在0.0μM NaAsO2組還是在1.0μM NaAsO2組均無(wú)甲基化發(fā)生。4.對(duì)亞砷酸鈉所致的惡性轉(zhuǎn)化的HaCaT細(xì)胞(T-HaCaT)進(jìn)行5-Aza

11、-dC處理后發(fā)現(xiàn)：經(jīng)5-Aza-dC處理后T-HaCaT細(xì)胞中Keap1啟動(dòng)子區(qū)(TSS之前，-433bp~-1bp)甲基化位點(diǎn)明顯減少，甲基化率下降至9.7±2.4%，較T-HaCaT細(xì)胞(93.1±2.4%)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。5-Aza-dC能夠明顯恢復(fù)T-HaCaT細(xì)胞中Keap1在總蛋白和核、漿蛋白中的表達(dá)水平，降低T-HaCaT細(xì)胞Nrf2的核累積水平和HO-1的表達(dá)水平。此外，經(jīng)5-Aza-dC處理后

12、的T-HaCaT細(xì)胞軟瓊脂克隆形成能力也較未處理的T-HaCaT細(xì)胞明顯降低(p<0.05)。
　　【結(jié)論】：
　　1.低水平亞砷酸鈉長(zhǎng)期染毒HaCaT細(xì)胞能夠誘導(dǎo)其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
　　2.低水平亞砷酸鈉長(zhǎng)期暴露致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中伴隨氧化-抗氧化系統(tǒng)的逐漸失衡，惡性轉(zhuǎn)化中后期ROS水平逐漸降低，而Nrf2介導(dǎo)的抗氧化水平則持續(xù)升高。
　　3. Keap1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平在惡性轉(zhuǎn)化中后期逐漸升高導(dǎo)