Keap1-Nrf2-ARE信號通路在砷致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的動態(tài)變化及其機制研究.pdf

1、【目的】：無機砷是人類確認致癌物，但由于砷與機體作用十分復雜，加之無機砷化合物至今尚未成功復制出致癌動物模型，其確切的致癌機制仍未明確。目前砷致氧化應激機制與砷致表觀遺傳改變是砷致癌機制的兩大熱點假說。Keap1-Nrf2/ARE是機體最重要的抗氧化信號通路，其能夠有效地保護機體免受各類氧化損傷。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)該信號通路持續(xù)活化則與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性密切相關。但該信號通路在腫瘤發(fā)生過程中的不同階段是如何變化及其變化機制目前尚

2、不清楚。本課題以低劑量亞砷酸鈉(NaAsO2)長期染毒人皮膚角質(zhì)形成細胞(Human keratinocyte cell, HaCaT)誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化為載體，研究ROS及Keap-Nrf2/ARE信號通路相關蛋白在惡性轉(zhuǎn)化過程中不同階段的動態(tài)變化，進而更深一步探討導致該信號通路表達變化可能的分子機制，為砷致癌機制研究提供新思路，同時為為癌癥的預防和治療過程中合理有效地利用和控制該通路提供新策略。
　　【方法】：1.建立低水平NaAs

3、O2長期暴露誘發(fā)HaCaT細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化模型：常規(guī)培養(yǎng)HaCaT細胞至貼壁并恢復形態(tài)后，換用含0.0和1.0μM NaAsO2的DMEM完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)至35代(約18周)。在該過程中不同階段(21代、28代、35代)進行細胞生長動力學及MMP-9分泌活性檢測，軟瓊脂克隆實驗檢測其克隆形成能力。2.低水平NaAsO2致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化不同階段(0、1、7、14、21、28、35代) Keap1-Nrf2/ARE信號通路相關指標

4、檢測：采用流式細胞儀檢測ROS水平變化；生化法檢測MDA含量及SOD酶活力變化；采用Western-Blot方法檢測細胞總蛋白及核漿蛋白中Nrf2、HO-1、Keap1及Bach1蛋白表達水平。3.低水平NaAsO2致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化中后期(14、28、35代) Keap1基因啟動子區(qū)DNA甲基化檢測：提取相關代數(shù) HaCaT細胞基因組 DNA，采用亞硫酸氫鹽修飾后測序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP

5、)檢測 Keap1基因啟動子區(qū) DNA甲基化情況。4.5-Aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-dC)處理后各指標檢測：將正常HaCaT細胞及1.0μM NaAsO2誘導的惡性轉(zhuǎn)化的HaCaT細胞(T-HaCaT)分別培養(yǎng)于含有0或10μM5-Aza-dC的DMEM培養(yǎng)基中5天后，采用BSP法進行Keap1基因啟動子區(qū)DNA甲基化檢測，采用Western-Blot法檢測Keap1-Nrf2/ARE信號通路各蛋白在總蛋白與

6、核漿蛋白中的表達變化，軟瓊脂克隆法檢測細胞克隆形成能力。
　　【結(jié)果】：
　　1．用1.0μM NaAsO2對HaCaT細胞進行連續(xù)染毒后發(fā)現(xiàn)：隨著染毒代數(shù)的增加，HaCaT細胞生長速率逐漸加快，其倍增時間在35代時明顯少于傳代對照組細胞，MMP-9分泌水平在35代也明顯升高，染毒35代細胞能夠在軟瓊脂中形成明顯的克隆集落，而正常HaCaT細胞在軟瓊脂中幾乎不能生長(p均<0.05)。2.對低水平NaAsO2致HaCaT細胞

7、惡性轉(zhuǎn)化不同階段ROS及Keap1-Nrf2/ARE信號通路各相關指標進行檢測發(fā)現(xiàn)：在染毒初期(1代) HaCaT細胞內(nèi)ROS水平明顯升高，隨后到染毒14代其表達呈輕微下降后上升趨勢，而在14代以后隨代數(shù)增加即惡性程度增加其ROS水平逐漸降低，在35代時其活力明顯低于初代(0代) HaCaT細胞(p<0.05)。MDA含量在染毒1代時達到峰值，隨后呈緩慢下降趨勢，但與同代數(shù)傳代對照組細胞相比均無統(tǒng)計學差異。在染毒初期(1代)細胞內(nèi)的Nr

8、f2及HO-1表達水平和SOD酶活力水平均有所上升。隨后至暴露14代呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在砷暴露后期(21代以后) Nrf2在細胞核中持續(xù)累積，且HO-1表達水平及SOD酶活力也呈持續(xù)升高趨勢。相反的，Keap1蛋白表達水平在暴露14代以后則呈持續(xù)下降趨勢。Bach1在胞漿中的表達水平隨著染毒代數(shù)的增加逐漸升高，而總蛋白中Bach1表達水平與傳代對照組相比則無明顯變化。3.對低水平NaAsO2致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化中后期Keap1基

9、因啟動子區(qū)甲基化水平檢測發(fā)現(xiàn)：在0.0μM NaAsO2組14、28及35代細胞中，Keap1基因啟動子區(qū)(TSS之前，-433bp~-1bp)存在較少的甲基化CpG位點，其甲基化率分別為6.0±3.1％、7.1±2.8%和6.3±3.8%，相互之間均無統(tǒng)計學差異。而在1.0μM NaAsO2組14、28及35代細胞中，Keap1基因啟動子區(qū)(TSS之前，-433bp~-1bp)則呈現(xiàn)明顯甲基化狀態(tài)，且隨著染毒代數(shù)的增加，其甲基化程度逐

10、漸增加，其甲基化率分別為51.1±6.5%、77.1±6.5%和90.6±4.3%，與同代數(shù)0.0μM NaAsO2組細胞相比均有明顯統(tǒng)計學差異(p<0.05)，且三組之間比較也均有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。而在TSS之后的第一啟動子區(qū)內(nèi)(+1bp~+159bp)的16個CpG位點無論在0.0μM NaAsO2組還是在1.0μM NaAsO2組均無甲基化發(fā)生。4.對亞砷酸鈉所致的惡性轉(zhuǎn)化的HaCaT細胞(T-HaCaT)進行5-Aza

11、-dC處理后發(fā)現(xiàn)：經(jīng)5-Aza-dC處理后T-HaCaT細胞中Keap1啟動子區(qū)(TSS之前，-433bp~-1bp)甲基化位點明顯減少，甲基化率下降至9.7±2.4%，較T-HaCaT細胞(93.1±2.4%)相比，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。5-Aza-dC能夠明顯恢復T-HaCaT細胞中Keap1在總蛋白和核、漿蛋白中的表達水平，降低T-HaCaT細胞Nrf2的核累積水平和HO-1的表達水平。此外，經(jīng)5-Aza-dC處理后

12、的T-HaCaT細胞軟瓊脂克隆形成能力也較未處理的T-HaCaT細胞明顯降低(p<0.05)。
　　【結(jié)論】：
　　1.低水平亞砷酸鈉長期染毒HaCaT細胞能夠誘導其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
　　2.低水平亞砷酸鈉長期暴露致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中伴隨氧化-抗氧化系統(tǒng)的逐漸失衡，惡性轉(zhuǎn)化中后期ROS水平逐漸降低，而Nrf2介導的抗氧化水平則持續(xù)升高。
　　3. Keap1基因啟動子區(qū)甲基化水平在惡性轉(zhuǎn)化中后期逐漸升高導