Wnt5a介導(dǎo)脫細(xì)胞干細(xì)胞基質(zhì)抑制軟骨細(xì)胞肥大化的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:探究脫細(xì)胞干細(xì)胞基質(zhì)(DSCM)促進(jìn)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(SMSCs)成半月板軟骨分化及抑制軟骨細(xì)胞肥大化的分子機(jī)制，明確信號(hào)通路中關(guān)鍵作用分子，構(gòu)建體外促進(jìn)SMSCs成軟骨分化及抑制軟骨細(xì)胞分化體系，為解決SMSCs在半月板軟骨組織工程中遇到的問題及臨床上半月板鈣化找到有效的方案。
　　研究方法:將SMSCs于傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶(Plastic)成軟骨誘導(dǎo)分化2周后，去除培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，降低地塞米松濃度，加

2、入甲狀腺激素進(jìn)行軟骨細(xì)胞肥大化誘導(dǎo)培養(yǎng)，探究軟骨細(xì)胞肥大化對(duì)半月板修復(fù)的影響;將SMSCs分別置于傳統(tǒng)培Plastic和DSCM擴(kuò)增培養(yǎng)后，置于Pellet系統(tǒng)中成軟骨誘導(dǎo)分化，檢測(cè)Sox9、Col1a1、Col2a1、aggrecan、GAG等纖維軟骨相關(guān)標(biāo)志物及ALP、MMP-13、Col10a1等細(xì)胞肥大化相關(guān)標(biāo)志物，探究DSCM抑制軟骨細(xì)胞肥大化作用;將經(jīng)DSCM擴(kuò)增培養(yǎng)的SMSCs置于Pellet系統(tǒng)中成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，

3、檢測(cè)Wnt5a的表達(dá)量;成軟骨培養(yǎng)中分別依次加入Wnt5a受體抑制劑UM206、Erk磷酸化抑制PD98059、p38MAPK抑制劑SB203580檢測(cè)軟骨相關(guān)和肥大化相關(guān)標(biāo)志物，探究Wnt5a等信號(hào)通路介導(dǎo)DSCM促進(jìn)SMSCs成軟骨分化、抑制軟骨細(xì)胞肥大性分化的分子機(jī)制;體外條件下，于傳統(tǒng)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入Wnt5a激動(dòng)劑，探究Wnt5a是否作為DSCM促進(jìn)SMSCs成軟骨分化、抑制軟骨細(xì)胞肥大性分化的關(guān)鍵因子。
　　研究

4、結(jié)果:SMSCs具有很強(qiáng)的貼壁生長(zhǎng)能力，成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)檢測(cè)陽(yáng)性。與成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)比較，SMSCs在甲狀腺激素刺激肥大化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)后，其細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的肥大化表型。誘導(dǎo)分化28天后，軟骨小球中軟骨細(xì)胞仍然表現(xiàn)肥大化狀態(tài)。對(duì)軟骨小球中的Ⅰ型膠原(COLⅠ)進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)成軟骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成的軟骨小球，其染色強(qiáng)度較經(jīng)肥大化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化成的軟骨小球強(qiáng)。Ⅹ型膠原(COLⅩ)在經(jīng)過(guò)成軟骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)的軟骨小球中染

5、色幾乎呈現(xiàn)陰性，但在肥大化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化的軟骨小球中其染色呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性。PCR結(jié)果顯示肥大化誘導(dǎo)促進(jìn)肥大化相關(guān)基因表達(dá)。將SMSCs分別置于含有和不含有DSCM的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，不含DSCM培養(yǎng)瓶中的SMSCs表現(xiàn)出肥大化細(xì)胞形態(tài)，而置于DSCM中擴(kuò)增培養(yǎng)的SMSCs保持其干性形態(tài)。將經(jīng)“Plastic”擴(kuò)增培養(yǎng)的SMSCs分別轉(zhuǎn)入“DSCM”和“Plastic”中擴(kuò)增培養(yǎng)，被轉(zhuǎn)入到“DSCM”中擴(kuò)增培養(yǎng)的SMSCs密度增高，而轉(zhuǎn)入到“Pl

6、astic”中擴(kuò)增培養(yǎng)的SMSCs密度沒有明顯變化;將經(jīng)“DSCM”擴(kuò)增培養(yǎng)的SMSCs分別轉(zhuǎn)入到“Plastic”和“DSCM”中擴(kuò)增培養(yǎng)，被轉(zhuǎn)入到“DSCM”中擴(kuò)增培養(yǎng)的SMSCs密度沒有明顯的變化，而轉(zhuǎn)入到“Plastic”中擴(kuò)增培養(yǎng)的SMSCs密度卻明顯的降低。DSCM可以顯著增加SMSCs增殖能力及成軟骨指數(shù)，即增加GAG/DNA比值。與在Plastic中成軟骨分化細(xì)胞，SMSCs在DSCM中擴(kuò)增培養(yǎng)后形成的軟骨小球體積顯著增

7、加，同時(shí)COLⅠ的表達(dá)量也顯著的增加。RT-PCR對(duì)成軟骨分化過(guò)程中Col1a1分子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與Plastic相比，DSCM可以顯著的增加ColⅠa1的表達(dá)。將SMSCs置于DSCM中成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)產(chǎn)生的軟骨小球Pellet體積變大、GAG及COLⅡ合成量增加，肥大化標(biāo)志基因ColⅩ、ALP及MMP-13表達(dá)被抑制。SMSCs分別置于傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶Plastic和DSCM中擴(kuò)增培養(yǎng)8天，然后置于Pellet系統(tǒng)中進(jìn)

8、行成軟骨誘導(dǎo)分化35天。分別采用RT-PCR和West blot對(duì)SMSCs成軟骨分化階段Wnt5a表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在SMSCs增殖培養(yǎng)階段，DSCM中Wnt5a表達(dá)量約是Plastic中Wnt5a表達(dá)量的5倍，而于成軟骨誘導(dǎo)分化階段，DSCM中Wnt5a表達(dá)量約是Plastic中Wnt5a表達(dá)量的5倍。SMSCs分別置于含有Wnt5a和不含有Wnt5a的傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增培養(yǎng)8天，同樣的，經(jīng)Wnt5a擴(kuò)增培養(yǎng)的SMSCs成軟骨

9、分化能力較強(qiáng)。Wnt5a能夠明顯的促進(jìn)纖維軟骨基因表達(dá)，同時(shí)能夠抑制ALP、MMP-13、Runx2、Col10a1等肥大化相關(guān)基因的表達(dá)。SMSCs分別置于含有PD98059和不含有PD98059的傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶Plastic中及含有PD98059和不含有PD98059的DSCM中擴(kuò)增培養(yǎng)8天，結(jié)果顯示，SMSCs于含有PD98059的培養(yǎng)基中擴(kuò)增時(shí)，其增殖能力較對(duì)照組顯著減弱。SMSCs分別置于含有SB203580和不含有SB20358

10、0的傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶Plastic中及含有SB203580和不含有SB203580的DSCM中擴(kuò)增培養(yǎng)后成軟骨誘導(dǎo)分化。結(jié)果顯示，SMSCs于含有SB203580的培養(yǎng)基中擴(kuò)增時(shí)，其成軟骨分化能力較對(duì)照組顯著減弱。
　　研究結(jié)論:體外條件下，SMSCs誘導(dǎo)分化成的軟骨細(xì)胞具有肥大化現(xiàn)象，使生的半月板版軟骨出現(xiàn)鈣化。DSCM可以促進(jìn)SMSCs成軟骨分化，抑制肥大性分化。DSCM中Wnt5a作為關(guān)鍵作用分子，具有促進(jìn)SMSCs成軟骨分化、抑