Wnt5a影響U937細胞中心體分離并抑制細胞惡性增殖的機制研究.pdf

1、目的：
　　 Wnt5a是一種分泌型糖蛋白，在機體的生長發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，若表達異常會導致發(fā)育畸形和腫瘤發(fā)生。有研究表明：Wnt5a可以激活不同的信號通路發(fā)揮不同生理功能，如在腫瘤發(fā)生中既能發(fā)揮促癌因子的作用，也能發(fā)揮抑癌因子的作用。近年來，國外和我們的研究發(fā)現(xiàn)：Wnt5a在大多數(shù)白血病細胞中表達下調(diào)，導致了白血病細胞惡性增殖；我們還在治療緩解的白血病病例中發(fā)現(xiàn)Wnt5a表達恢復；在髓系白血病U937細胞株中，外源性Wnt5

2、a可下調(diào)β-catenin的表達，并阻滯細胞的有絲分裂進程，抑制了白血病細胞的惡性增值，但其機制尚不明確。本研究以髓系白血病細胞株U937為模型，采用免疫印跡、免疫沉淀、免疫熒光和RNA干擾等技術(shù)，研究Wnt5a在白血病細胞中發(fā)揮抑癌因子的作用機制。深入探討：Wnt5a是否通過Ror2受體激活JNK/GSK-3β途徑，促進β-catenin的磷酸化和降解，并下調(diào)其下游靶基因的表達，進而抑制細胞的惡性增殖；Wnt5a是否通過Ror2/JN

3、K/GSK-3β途徑調(diào)控中心體上β-catenin的表達和磷酸化，抑制中心體的分離，進而阻滯細胞有絲分裂的進程。該研究有利于從多方面揭示W(wǎng)nt5a在白血病中發(fā)揮抑癌因子的作用機制，對深入認識白血病發(fā)病機理和不斷提高白血病的診療水平均有重要研究價值。
　　 方法：
　　 1.Wnt5a對髓系白血病細胞中β-catenin表達和細胞增殖影響的研究
　　 1.1.用RT-PCR、MSP(甲基化特異性PCR)檢測髓系白血

4、病骨髓標本中Wnt5a表達及其啟動子的甲基化狀態(tài)；分別用免疫細胞化學染色和Western blot檢測病例骨髓細胞和U937細胞株中Wnt5a和β-catenin的表達。
　　 1.2.用Western blot檢測外源性Wnt5a處理U937細胞前后，β-catenin及其下游靶基因Cyclin D1、C-myc的表達情況。
　　 1.3.用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測外源性Wnt5a處理U937細胞后，β-catenin的

5、轉(zhuǎn)錄活性。
　　 1.4.用MTT和流式細胞術(shù)檢測外源性Wnt5a處理U937細胞后，細胞的增殖活力。
　　 2.U937細胞中Wnt5a通過Ror2途徑下調(diào)β-catenin的機制研究
　　 2.1.免疫組化檢測急性髓系白血病和健康人骨髓有核細胞中Ror2和LRP5受體的表達情況。
　　 2.2.用激光共聚焦顯微鏡檢測U937細胞中、Wnt5a、Ror2和LRP5的表達定位情況，用免疫沉淀法檢測Wnt5

6、a與Ror2、LRP5受體結(jié)合，用Western blot檢測Ror2與LRP5受體表達的情況。
　　 2.3.用Western blot檢測相應抑制因素處理后(如：Ror2Ab、LiC1和SP600125)再以Wnt5a處理的U937細胞中JNK-p、GSK-3β-p、GSK-3β、β-catenin-p和β-catenin的表達。
　　 3.Wnt5a/Ror2通過非經(jīng)典途徑對中心體分離和細胞增殖的影響
　　

7、 3.1.用Western blot檢測各種條件下(如：Ror2Ab和Ad-Si-β-catenin)，Wnt5a處理的U937細胞中心體上β-catenin的表達。
　　 3.2.用免疫熒光檢測中心體上β-catenin的表達改變對中心體分離的影響。
　　 3.3.用免疫熒光檢測中心體上GSK-3β和β-catenin的分布與定位，用免疫沉淀法檢測中心體上GSK-3β和β-catenin的結(jié)合情況，用Western b

8、lot檢測在各種條件下(如：Ror2Ab、LiC1和SP600125)Wnt5a處理U937后，細胞中心體上β-catenin的磷酸化情況。
　　 3.4.用激光共聚焦顯微鏡觀察中心體上β-catenin的磷酸化對中心體分離的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.髓系白血病病例中，Wnt5a因其啟動子甲基化而致表達下調(diào)，低表達Win5a的U937細胞株中β-catenin高表達。
　　 2.外源性Wnt5a通過

9、下調(diào)U937細胞中β-catenin的表達，并抑制β-catenin/TCF4的轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)其靶基因Cyclin D1、C-myc的表達。
　　 3.外源性Wnt5a處理U937細胞后，可阻滯細胞的有絲分裂進程，抑制細胞惡性增殖。
　　 4.與健康人相比，急性髓系白血病病例骨髓有核細胞中Ror2受體表達較低，而LRP5受體表達較高。
　　 5.Wnt5a可上調(diào)U937細胞中Ror2受體的表達，并與Ror2受

10、體結(jié)合的優(yōu)勢強于LRP5受體。
　　 6.Wnt5a與Ror2受體結(jié)合后，可激活JNK/GSK-3β非經(jīng)典Wnt信號，下調(diào)U937細胞中總β-catenin和中心體上β-catenin表達，促進細胞中心體上β-catenin的磷酸化，并抑制中心體的分離。
　　 結(jié)論：
　　 在髓系白血病U937細胞株中，Wnt5a/Ror2/JNK/GSK-3β非經(jīng)典Wnt信號途徑通過影響經(jīng)典Wnt信號核心分子--β-caten