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1、近年來胎盤干擾素(interferontau,IFN-τ)作為新發(fā)現(xiàn)的一種Ⅰ型干擾素,越來越受到人們的重視。IFN-τ最初被稱為滋養(yǎng)層蛋白-1(trophoblastprotein-1,TP-1)或滋養(yǎng)層素(trophoblastin),是反芻動(dòng)物在懷孕早期由滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一類蛋白質(zhì),它是反芻動(dòng)物母體妊娠識(shí)別孕體的信號(hào),在黃體維持和妊娠建立過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。 IFN-τ屬于Ⅰ型干擾素,具有Ⅰ型干擾素的許多共同特性,具
2、有抗病毒、抗細(xì)胞增生、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能。但I(xiàn)FN-τ也有自身特點(diǎn),與其他的干擾素不同,它僅在反芻動(dòng)物懷孕早期由胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞在孕體植入前后的一段時(shí)間表達(dá),無需病毒誘導(dǎo);它顯現(xiàn)出強(qiáng)的抗HIV等逆轉(zhuǎn)錄病毒活性;對(duì)多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型有明顯的免疫抑制作用;它能夠作用于多種細(xì)胞,具有跨種系的特點(diǎn);可以減少反芻動(dòng)物的胚胎和胎兒的流產(chǎn)率;此外,高濃度IFN-τ表現(xiàn)出較其他Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)所沒有或較小的細(xì)胞毒性?;谄涮赜械目共《?/p>
3、活性及低細(xì)胞毒性,為許多疾病的治療帶來新的希望。 隨著IFN-τ在臨床研究工作的不斷深入,人們需要大量高純度、有活性IFN-τ用于疾病的治療研究。從反芻動(dòng)物孕體內(nèi)可以獲得具有高度活性的IFN-τ,但是步驟繁瑣、產(chǎn)量較低。目前,在國(guó)外已經(jīng)有人通過大腸桿菌以融合蛋白的形式表達(dá)并純化出重組IFN-τ,亦有人通過酵母菌、昆蟲-桿狀病毒等表達(dá)并純化出重組IFN-τ。大腸桿菌可以高效表達(dá)IFN-τ成熟肽,由于IFN-τ以包涵體的形式表達(dá),需
4、要進(jìn)行純化和復(fù)性,這是本實(shí)驗(yàn)要解決的問題之一。 目前對(duì)IFN-τ抗黃體溶解以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)調(diào)控等機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了不同程度的研究;對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒作用也作了大量的研究工作;該藥作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑治療多發(fā)性硬化,自1999年在美國(guó)已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床階段。另外,有文獻(xiàn)報(bào)道IFN-τ可以抑制牛的MDBK細(xì)胞、鼠L929細(xì)胞以及人的WISH細(xì)胞的增殖,但尚無文獻(xiàn)報(bào)道IFN-τ對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。本實(shí)驗(yàn)旨在應(yīng)用純化并經(jīng)過復(fù)性的重組綿羊胎盤干
5、擾素(roIFN-τ)檢測(cè)其對(duì)急性粒單核細(xì)胞白血病細(xì)胞U937的影響。 研究目的: 本實(shí)驗(yàn)的主要目的是建立有效的純化roIFN-τ的方法,以獲得大量高純度的roIFN-τ。另外,初步檢測(cè)roIFN-τ在體外對(duì)U937細(xì)胞增殖的影響及其可能的機(jī)制。 研究方法: 1、roIFN-τ的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒pBV220轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌EcoliBL21,獲得了高效表達(dá)外源蛋白roIFN-τ的工程菌。在
6、30℃發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速和通氣量是培養(yǎng)基的容氧值保持在20%以上;利用2mol/L的NaOH和1mol/L的HCI調(diào)節(jié)pH值。以葡萄糖為碳源,酵母提取物和蛋白胨為氮源,補(bǔ)充養(yǎng)料。迅速升溫至42℃誘導(dǎo)表達(dá),roIFN-τ以包涵體的形式存在。利用超聲裂解法破裂細(xì)菌,經(jīng)多次反復(fù)洗滌后收集包涵體,用含8mol/L尿素的包涵體溶解液溶解目的蛋白,利用飽和硫酸銨溶液初步沉淀和純化,再用尺寸排阻層析法純化出較高純度的roIFN-
7、τ。 2、roIFN-τ的體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人類單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞加入不同濃度的roIFN-τ,應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)還原法檢測(cè)roIFN-τ對(duì)U937細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及fas、fasl和bcl-2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。 研究結(jié)果: 1、發(fā)酵誘導(dǎo)4小時(shí)后的菌體用15%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳,得到與預(yù)期
8、蛋白分子量大小一致(21KD)的特異條帶。包涵體溶解液經(jīng)過硫酸銨初步沉淀,再經(jīng)過凝膠過濾色譜層析純化出高純度的目的蛋白;純化樣品的SDS-PAGE電泳圖譜經(jīng)Totallab軟件分析可知roIFN-τ的純度達(dá)到98.52%。 2、根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出roIFN-τ對(duì)U937細(xì)胞增殖有明顯抑制作用并呈劑量依賴性。0.445mg/ml、0.178mg/ml、0.089mg/ml和0.044mg/ml的roIFN-τ在作用48小時(shí)
9、后的生長(zhǎng)抑制率分別是60.97%、41.31%、20.82%和8.15%。FCM實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示roIFN-τ可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡(p<.05);并且影響細(xì)胞周期,將細(xì)胞周期阻滯在S期(p<0.05);roIFN-τ上調(diào)fasl和bcl-2的表達(dá)(p<0.05),但對(duì)fas的表達(dá)沒有明顯的影響(p>0.05)。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)建立了簡(jiǎn)單可行的可獲得具有高純度的roIFN-τ純化方法。 體外實(shí)驗(yàn)顯示roIFN-τ可以抑制U
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