黃連素調(diào)節(jié)人源alpha6型尼古丁受體及機(jī)制的研究.pdf

1、背景和目的：神經(jīng)元型尼古丁乙酰膽堿受體（nAChRs）在調(diào)節(jié)大腦的功能中扮演著許多重要的角色。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)nAChRs除介導(dǎo)尼古丁成癮外還與多種神經(jīng)和精神系統(tǒng)疾病有關(guān)。nAChRs由多種不同的α或α和β亞單位組成，分布在神經(jīng)系統(tǒng)的不同部位，具有不同的功能作用和藥理學(xué)特性。含有α6亞單位的尼古丁乙酰膽堿受體（α6*-nAChRs）是其中的一類(lèi)非常重要的受體，雖然在大腦中分布并不廣泛，但其主要集中在中腦多巴胺能神經(jīng)元所分布的區(qū)域，而這一區(qū)域

2、與人的愉悅，獎(jiǎng)賞和情緒控制，尤其是與藥物成癮有關(guān)，又稱(chēng)獎(jiǎng)賞中樞。因此推測(cè)α6*-nAChRs可能參與調(diào)節(jié)中腦多巴胺環(huán)路相關(guān)的生理和和病理生理以及參與藥物的獎(jiǎng)賞和成癮。然而，人們迄今對(duì)α6*-nAChRs的功能，藥理和調(diào)節(jié)認(rèn)知甚少，主要原因是目前尚無(wú)α6*-nAChR的選擇性激動(dòng)劑，且人為轉(zhuǎn)染α6和其它β亞單位至細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不能很好地形成具有功能的α6*-nAChRs?，F(xiàn)在，美國(guó)Barrow Neurological Institute的

3、Dr.Whiteaker lab已經(jīng)成功地將功能性α6*-nAChRs轉(zhuǎn)入人源SH-EP1細(xì)胞系，而且可以確定異源性表達(dá)功能性α6*-nAChRs的SH-EP1細(xì)胞系是研究α6*-nAChRs良好的細(xì)胞模型。黃連素是從黃連根中提取的一種天然的異喹啉類(lèi)生物堿，又名鹽酸小檗堿。它是中國(guó)傳統(tǒng)的一味中藥，具有良好的抗菌作用，主要用于治療腸道細(xì)菌感染。但是，新近的證據(jù)表明黃連素可能還具有其他的一些新作用，包括治療心律失常、糖尿病、高血脂和癌癥。但

4、是黃連素是否能影響尼古丁受體，是否能用于控制藥物成癮，尤其是吸煙導(dǎo)致的尼古丁成癮，仍不清楚。本課題致力于研究黃連素對(duì)人源α6*-nAChRs的影響，以闡明黃連素的新作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型的戒煙藥物提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　1）轉(zhuǎn)染的人源尼古丁受體：將α6(N-terminal)+α3(transmembrane domain)+β2β3(α6N/α3Cβ2β3 nAChRs,簡(jiǎn)寫(xiě)為α6*-n

5、AChR)轉(zhuǎn)入人源上皮腫瘤細(xì)胞系（SH-EP1）中使α6*-nAChRs穩(wěn)定表達(dá)于培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞膜上用于膜片鉗記錄。
　　2）爪蛙卵細(xì)胞：α6(N-terminal)+α3(transmembrane domain and C-terminal)+β2β3或α6全段(N-terminal+transmembrane domain)擁有一個(gè)點(diǎn)突變+β2β3的DNA微注射入蛙卵細(xì)胞以表達(dá)功能性α6*-nAChRs用于雙電極電壓鉗記錄。<

6、br>　　3）C57BL/J6小鼠:成年雄性小鼠用于撿測(cè)黃連素對(duì)尼古丁引起的位置偏好反應(yīng)。
　　膜片鉗全細(xì)胞記錄
　　在鉗制電壓為-40mV的條件下記錄尼古丁引起α6*-nAChR所介導(dǎo)的全細(xì)胞內(nèi)向電流反應(yīng)，然后撿測(cè)黃連素對(duì)該電流反應(yīng)的影響。
　　雙電極電壓鉗技術(shù)
　　為了進(jìn)一步研究藥物作用位點(diǎn)，我們將突變體α6*-nAChRs導(dǎo)入蛙卵細(xì)胞，作為另一種細(xì)胞模型。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中我們使用雙電極電壓鉗技術(shù)，將表達(dá)α6*-

7、nAChRs的蛙卵細(xì)胞用Axoclamp900A放大器把電壓維持在-70mV。藥物溶于卵母細(xì)胞緩沖液通過(guò)16通道自重力灌流系統(tǒng)，通過(guò)自動(dòng)閥門(mén)控制。
　　藥物通過(guò)計(jì)算機(jī)控制的U型管給藥系統(tǒng)，可將藥物快速灌流到細(xì)胞表面（～30ms）。胞內(nèi)給藥是將黃連素溶于電極內(nèi)液中，當(dāng)形成全細(xì)胞封接狀態(tài)時(shí)，等待至少20分鐘，以保證電極內(nèi)液和和細(xì)胞內(nèi)液進(jìn)行充分對(duì)流交換，確保黃連素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
　　條件性位置偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)（Conditioned pla

8、ce preference,CPP）
　　分為三組：（1）生理鹽水+尼古丁為陽(yáng)性對(duì)照組，（2）黃連素+尼古丁為實(shí)驗(yàn)組，（3）黃連素+生理鹽水為黃連素對(duì)照組。黃連素給藥方式為灌胃，劑量為20mg/kg。尼古丁為腹腔注射，計(jì)量是0.5mg/kg。生理鹽水在（1）組為灌胃方式，容量同實(shí)驗(yàn)組的黃連素。生理鹽水在（3）組為腹腔注射，容量同陽(yáng)性對(duì)照組（2）的尼古丁。動(dòng)物預(yù)適應(yīng)3天，注射4天（每日二次），然后撿測(cè)CPP。
　　數(shù)據(jù)的處理,

9、分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)
　　使用Clampfit10.6、Excel、Origin8、GraphPad Prism7這些軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的離線(xiàn)分析。兩組數(shù)據(jù)間比較用t-test，兩組以上數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。
　　結(jié)果與結(jié)論：
　　1）轉(zhuǎn)入α6*-nAChRs的SH-EP1細(xì)胞系，可以作為研究黃連素對(duì)α6*-nAChRs藥理學(xué)特性的模型細(xì)胞。
　　2）尼古丁可以激活α6*-nAChRs產(chǎn)生全

10、細(xì)胞電流，該反應(yīng)可以被黃連素抑制，而且具有濃度依賴(lài)性。
　　3）黃連素抑制α6*-nAChRs的藥理學(xué)機(jī)制是一種非競(jìng)爭(zhēng)型抑制，實(shí)驗(yàn)證明黃連素對(duì)α6*-nAChR的抑制在高濃度和低濃度尼古丁引起的反應(yīng)是相似的。
　　4）胞內(nèi)給予GDP-βS（600μM）以阻斷受體的內(nèi)化，但不能抑制黃連素引起的抑制作用，說(shuō)明此抑制作用不是由于α6*-nAChRs內(nèi)化所致。
　　5）黃連素對(duì)α6*-nAChRs的突變體（含有全α6的結(jié)構(gòu)但擁

11、有一個(gè)突變點(diǎn)）的抑制作用與SH-EP1細(xì)胞α6/α3的嫁接體α6*-nAChRs的抑制類(lèi)似，這說(shuō)明黃連素的作用位點(diǎn)可能是在α6*-nAChRs（N端）而不在α3-nAChRs的跨膜區(qū)上。
　　6）條件性位置偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組的黃連素可以減輕由尼古丁引起的小鼠條件性位置偏愛(ài)作用。
　　綜上所述，本課題利用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)在不同水平的細(xì)胞和動(dòng)物模型首次闡明了黃連素對(duì)α6*-nAChRs的拮抗作用及其作用機(jī)制。這一新發(fā)現(xiàn)將對(duì)理解黃連素