黃連素對(duì)2型糖尿病腎病大鼠及QDPR基因啟動(dòng)子的作用及機(jī)制研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、背景:
  糖尿病(diabetic mellitus,DM)是嚴(yán)重危害國(guó)民健康的重大疾病。2010年我國(guó)學(xué)者發(fā)表在《New England Journal of Medicine》對(duì)我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查表明:20歲以上成年人DM患病人口為9240萬,而DM前期患病人口約為1.48億。而該數(shù)據(jù)在2013已被刷新。同年發(fā)表在《JAMA》上的數(shù)據(jù)顯示:我國(guó)成年人DM患病人口已經(jīng)達(dá)到11.6%,即中國(guó)成年人DM患病人口為1.139億,而DM

2、前期人口預(yù)計(jì)為為50.1%,即糖尿病前期患病人口為4.934億。糖尿病腎病(diabeticnephropathy, DN)是DM嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示,DN在我國(guó)已經(jīng)成為導(dǎo)致老年終末期腎病的首要原因,是國(guó)民健康的嚴(yán)重危險(xiǎn)因素,但目前仍然缺乏對(duì)其的有效治療手段?;颊咭坏┌l(fā)現(xiàn)大量蛋白尿,其腎功能將進(jìn)行性下降,最終進(jìn)展為終末期腎病。因此,尋找防治DN的有效藥物是醫(yī)學(xué)科研人員的目標(biāo),以此保證人民健康和提高患者生活治療的迫

3、切需求。
  黃連素(berberine,BBR),又名鹽酸小檗堿,是從黃連、黃柏等植物中提取的生物堿。黃連素作為抗菌藥已被臨床廣泛應(yīng)用于痢疾桿菌所致的腸道感染。近年來研究發(fā)現(xiàn)該藥尚能治療DM、高血壓及心律失常等心血管疾病。關(guān)于黃連素對(duì)DN的研究越來越受關(guān)注。已有一些對(duì)黃連素治療DN的療效觀察及機(jī)制研究,多從改善胰島素抵抗,降低血糖,降低血壓和血脂,抗炎及改善氧化應(yīng)激等方面研究。但目前缺少對(duì)黃連素干預(yù)2型DN的長(zhǎng)期療效觀察及作用機(jī)

4、制研究。
  李平教授研究團(tuán)隊(duì)在前期差異蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)現(xiàn),二氫生物喋呤還原酶(dihydropteridine reductase,QDPR)在自發(fā)性2型糖尿病模型OLETF大鼠腎臟損害時(shí),編碼此蛋白的基因發(fā)生點(diǎn)突變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),QDPR可以增加BH4和nNOS基因表達(dá),下調(diào)TGFβ1,Smad3以及NOXs各亞基的蛋白和基因表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用;在體外高表達(dá)QDPR可以增強(qiáng)自噬相關(guān)基因的表達(dá),增強(qiáng)自噬活性。因此,Q

5、DPR可能作為DN的潛在生物標(biāo)記物和藥物作用靶點(diǎn),對(duì)QDPR啟動(dòng)子的研究勢(shì)在必行。
  目的:
  觀察黃連素對(duì)于高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)2型DN大鼠模型的腎臟保護(hù)作用,及其機(jī)制是否與抑制炎癥、纖維化和改善脂代謝紊亂有關(guān);構(gòu)建DN相關(guān)基因QDPR啟動(dòng)子片段,對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域定位,觀察黃連素對(duì)其活性影響。
  方法:
  1.黃連素對(duì)2型DN大鼠的腎臟保護(hù)作用及機(jī)制
  1.1黃連素對(duì)2型DN大鼠的腎臟保護(hù)

6、作用:本實(shí)驗(yàn)通過高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)2型DN大鼠模型,給予黃連素連續(xù)灌胃給藥20w。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠測(cè)血糖水平,4周一次;每4周收集實(shí)驗(yàn)大鼠24h尿;20周時(shí)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,腹主動(dòng)脈取血,收集血清,日立全自動(dòng)血生化儀測(cè)定各項(xiàng)血生化指標(biāo);收集腎組織用一半用于組織病理學(xué)染色,其余腎組織用于分子生物學(xué)檢測(cè)。
  1.2黃連素通過抑制NF-κB通路減輕2型DN大鼠腎臟炎癥:對(duì)高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)2型DN大鼠模型,進(jìn)行免疫組織

7、化學(xué),western blot以及realtime PCR等方法檢測(cè)炎癥指標(biāo)(ED-1、IL-1β、TNF-α和MCP-1),并研究NF-κB炎癥信號(hào)通路(p-p65、p65、p-IκBα、IκBα)。
  1.3黃連素通過抑制TGFβ/Smad通路減輕2型DN大鼠腎臟纖維化:對(duì)高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)2型DN大鼠模型,進(jìn)行免疫組織化學(xué),western blot以及realtime PCR等方法檢測(cè)纖維化指標(biāo)(collagen

8、Ⅰ、collagenⅣ和Fibronectin),并研究TGFβ/Smad信號(hào)通路(TGFβ、pTβRⅠ、TβRⅠ、TβRⅡ、p-Smad2/3,Smad2/3,Smad7,Smurf2)。
  1.4黃連素通過調(diào)節(jié)LOX-1/ABCA-1平衡改善2型DN大鼠腎臟脂質(zhì)沉積:對(duì)高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)2型DN大鼠模型,進(jìn)行油紅O染色,western blot以及realtime PCR等方法檢測(cè)膽固醇攝入及流出指標(biāo)(LOX-Ⅰ、

9、RXRα、RXRβ和ABCA-1)。
  2.黃連素對(duì)QDPR啟動(dòng)子功能區(qū)域影響初探
  2.1 QDPR啟動(dòng)子功能區(qū)域的構(gòu)建:從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取大鼠QDPR基因組序列,利用啟動(dòng)子在線分析軟件(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)對(duì)該基因起始密碼子ATG5'上游約2kb的序

10、列進(jìn)行分析,對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用DNAStar軟件進(jìn)行DNA序列對(duì)比和酶切位點(diǎn)分析。利用T-A載體進(jìn)行克隆,而后亞克隆至pGL3-Basic表達(dá)載體,利用酶切鑒定及測(cè)序分析判斷啟動(dòng)子構(gòu)建正確與否。
  2.2黃連素對(duì)QDPR啟動(dòng)子功能區(qū)域的影響:黃連素(濃度為5μM,10μM)干預(yù)高糖(30mM)刺激瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有QDPR啟動(dòng)子不同片段的HEK293T細(xì)胞,通過雙螢光素酶報(bào)告基因活性分析,分析黃連素對(duì)于QD

11、PR基因啟動(dòng)子活性的影響。
  結(jié)果:
  1.黃連素對(duì)2型DN大鼠的腎臟保護(hù)作用及機(jī)制
  1.1黃連素對(duì)2型DN病大鼠的腎臟保護(hù)作用:實(shí)驗(yàn)期間,Normal組大鼠血糖水平穩(wěn)定在正常水平;造模成功后DN組大鼠血糖維持在高水平,黃連素治療第4周開始降低大鼠血糖水平,其作用可持續(xù)至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取材時(shí),DN組大鼠腎重指數(shù)明顯高于Normal組大鼠,黃連素治療可顯著改善升高的腎重指數(shù);DN大鼠血清總蛋白及白蛋白水平降低

12、,尿素氮水平升高,而血肌酐水平未見明顯變化;在給予黃連素治療后,白蛋白水平上升,尿素氮水平下降。DN大鼠尿微量白蛋白水平隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展而上升,在給予黃連素治療第8周開始下降,并持續(xù)至第20周。病理染色可見Normal組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常,腎小管結(jié)構(gòu)清晰,背靠背排列緊密,腎小管上皮細(xì)胞排列整齊,間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DN組大鼠腎小球官腔結(jié)構(gòu)異常,系膜基質(zhì)增生顯著,基底膜增厚;腎小管上皮變性,部分腎小管官腔擴(kuò)張,間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);黃連素

13、治療明顯減輕DN大鼠腎臟病理改變。
  1.2黃連素通過抑制NF-κB通路減輕2型DN大鼠腎臟炎癥:在高脂聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的2型DN大鼠模型腎臟炎癥浸潤(rùn)明顯,在腎小球及腎小管間質(zhì)充斥巨噬細(xì)胞;給予黃連素治療后,浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞明顯減少。相似地,一些反應(yīng)炎癥狀態(tài)的指標(biāo),如MCP-1,TNF-α及IL-1β在DN模型大鼠腎臟中表達(dá)升高,而黃連素治療能夠顯著減少上述指標(biāo)的基因及蛋白水平表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在DN模型大鼠腎臟中,磷酸活化的N

14、F-κB(p-p65)蛋白水平上升,而磷酸化的IκBα(p-IκBα)表達(dá)減少。
  1.3黃連素通過抑制TGFβ/Smad通路減輕2型DN大鼠腎臟纖維化:2型DN進(jìn)展到20周時(shí),腎臟纖維化明顯:collagenⅠ,collagenⅣ以及Fibronectin在mRNA及蛋白水平都顯著升高;黃連素治療能夠顯著改善DN腎臟纖維化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),DN大鼠腎臟中磷酸化的TβRⅠ表達(dá)增強(qiáng),TβRⅡ的改變具有上升趨勢(shì)。此外,致病性Smad

15、3磷酸活性增強(qiáng),保護(hù)性Smad7表達(dá)降低,促進(jìn)Smad7降解的Smurf2表達(dá)上升。黃連素治療能夠降低磷酸化TβRⅠ、磷酸化Smad3及Smurf2表達(dá),增加Smad7表達(dá),從而抑制纖維化。
  1.4黃連素通過調(diào)節(jié)LOX-1/ABCA-1平衡改善2型DN大鼠腎臟脂質(zhì)沉積:在高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)的2型DN大鼠模型表現(xiàn)出明顯的血脂紊亂,包括血液循環(huán)中顯著升高的甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇,高密度脂蛋白膽固醇的變化雖無

16、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。油紅O染色發(fā)現(xiàn)2型DN大鼠腎臟局部存在大量脂滴沉積。給予黃連素治療后,病變大鼠的脂代謝紊亂得以顯著改善。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),DN狀態(tài)時(shí)LOX-1表達(dá)上升而ABCA-1表達(dá)下降,造成膽固醇攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)失衡,繼而發(fā)生脂代謝紊亂;給予黃連素治療后,能夠下調(diào)LOX-1表達(dá),上調(diào)ABCA-1及其調(diào)節(jié)受體LXR/RXR表達(dá)。
  2.黃連素對(duì)QDPR啟動(dòng)子功能區(qū)域影響初探
  2.1 QDPR啟動(dòng)子功能區(qū)域

17、的構(gòu)建:本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建含有大鼠QDPR基因翻譯起始位點(diǎn)上游2092bp序列的螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒,同時(shí)構(gòu)建該區(qū)域缺失片段的螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒,通過酶切及測(cè)序鑒定確認(rèn)成功構(gòu)建大鼠QDPR基因啟動(dòng)子片段。
  2.2黃連素對(duì)QDPR啟動(dòng)子功能區(qū)域的影響:在高脂聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)的2型DN大鼠模型腎臟中,QDPR表達(dá)減少;同樣地,在體外使用高糖誘導(dǎo)HBZY細(xì)胞,QDPR表達(dá)降低。高糖刺激HEK293T細(xì)胞,QDPRp1(QD

18、PR啟動(dòng)子全片段)的熒光素酶活性顯著降低,而QDPRp2(QDPR啟動(dòng)子部分缺失片段)的熒光素酶活性顯著升高。然而在給予黃連素干預(yù)高糖刺激后的HEK293T細(xì)胞后,QDPRp1應(yīng)答明顯增強(qiáng),并且作用呈劑量依賴性;相反地,給予黃連素治療后的QDPRp2應(yīng)答減弱。
  結(jié)論:
  1.黃連素對(duì)2型糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用及機(jī)制:
  黃連素治療高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)的2型DN大鼠,可顯著降低腎重指數(shù)、血糖、血脂以及尿

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