早期糖尿病腎病循環(huán)microRNA指紋譜的建立及相關(guān)miRNA基因啟動子甲基化調(diào)控作用的研究.pdf

1、第一部分、建立早期糖尿病腎病循環(huán)miRNA指紋譜
　　目的：建立早期糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)循環(huán)microRNA(miRNA)指紋譜，為糖尿病腎病的早期分子診斷和治療提供依據(jù)。
　　方法：使用PAXgeneTM blood RNA tubes采集早期糖尿病腎病和糖尿病(Diabetes mellitus，DM)患者的新鮮血液各3例，Trizol法提取總RNA，YM-100微離心過濾柱富集片

2、段小于300 nt的小RNA，經(jīng)過修飾處理后與含有最新版本探針序列(Version10.0 microRNA數(shù)據(jù)庫，http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)的RNA芯片雜交和特異性的熒光染料染色，經(jīng)過軟件分析和數(shù)據(jù)處理后，獲得早期糖尿病腎病和糖尿病的差異表達譜。通過TaqMan(@)MicroRNA Assays定量RT-PCR試劑盒對6個樣本中的let-7a的表達水平進行定量檢測，驗證RNA芯片

3、結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)果：RNA芯片檢測結(jié)果顯示早期糖尿病腎病和糖尿病血液中的miRNA有22個差異表達較明顯的，通過比較共篩選出10個糖尿病腎病顯著差異miRNAs，其中表達上調(diào)的miRNAs為5個，分別是hsa-miR-4429、 hsa-miR-4454、 hsa-miR-320e、 hsa-miR-320b和hsa-miR-320d，表達下調(diào)的miRNAs為5個，分別是hsa-let-7f、hsa-miR-363、hsa-

4、let-7a、hsa-let-7d、hsa-miR-26a。通過定量RT-PCR檢測了let-7a的表達水平，結(jié)果與芯片結(jié)果一致，表明芯片結(jié)果是可靠的。
　　結(jié)論：早期糖尿病腎病和糖尿病患者的部分循環(huán)miRNAs表達具有顯著差異，建立早期糖尿病腎病循環(huán)miRNA指紋譜可能為糖尿病腎病的早期分子診斷和治療提供新的思路。
　　第二部分、let-7a-3基因啟動子甲基化對早期糖尿病腎病的調(diào)控作用
　　目的：檢測早期糖尿病腎病

5、（DN組）、糖尿病（DM組）和正常人(CON組)全血DNA中l(wèi)et-7a-3基因啟動子的甲基化水平，探討基因啟動子甲基化對let-7a表達的影響，為研究調(diào)控早期糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展的分子機制提供新的線索。
　　方法：熒光定量甲基化特異性PCR(qMSP)檢測DN組、DM組和CON組全血DNA樣本各20例的let-7a-3基因啟動子甲基化率，PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳和克隆測序的方法驗證PCR反應(yīng)的準確性。
　　結(jié)果：qMS

6、P法檢測let-7a-3基因啟動子的甲基化水平，顯示DN組平均甲基化率為96.2％，DM組平均甲基化率為76.6％，正常組平均甲基化率為63.2％，經(jīng)統(tǒng)計分析，DN組平均甲基化率明顯高于DM組和正常組(P＜0.05)，而DM組和正常組相比，增高并不明顯(P＞0.05)。
　　結(jié)論：早期糖尿病腎病患者let-7a-3基因啟動子的甲基化水平明顯增高，影響let-7a-3基因的表達，使得let-7a的表達量下降（RNA芯片和定量RT-P