棉酚對2型糖尿病大鼠腎臟的保護作用及機制探討.pdf

1、目的： 1.觀察棉酚對2型糖尿病大鼠腎臟形態(tài)和功能的影響。 2.探討TGF-β1、SGK1、FN、Col-Ⅳ在DN發(fā)病中的作用及棉酚干預(yù)的作用機制。 3.觀察2型糖尿病大鼠腎臟11β-HSD2、11β-HSD1基因表達變化并初步探討棉酚對其表達的影響。 方法：雄性SD大鼠30只隨機分成三組：正常對照組10只、2型糖尿病組10只、棉酚于預(yù)組10只。后二組喂以高脂飼料(飼料組成：10.0％豬油，20.0％蔗糖

2、，2.5％膽固醇，1.0％膽酸鹽，66.5％常規(guī)飼料)一個月，誘發(fā)胰島素抵抗。2型糖尿病組、棉酚干預(yù)組人鼠在禁食12h后按30mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(溶于0.1mmol/L枸椽酸緩沖液內(nèi)，PH=4.0)，注射后1周測空腹血糖，≥8mmol/L為模型成功。正常對照組腹腔注射等容積枸椽酸緩沖液。此后，棉酚干預(yù)組按15mg.kg-1.d-1劑量棉酚(溶于2％羧甲基纖維素)灌胃4周，從第5周起，按15mg/kg劑量棉酚每周給予維持劑量一次

3、至第12周末。正常對照組與糖尿病組給予等容積的2％羧甲基纖維素灌胃，灌胃次數(shù)及時間同棉酚干預(yù)組。治療結(jié)束，記錄24小時尿量，禁食12小時后，股動脈放血處死大鼠，觀測以下指標：(1)血清指標：生化檢測血糖、SCr、BUN、TC、TG、LDL-c、HDL-c、Na+、K+水平；ELISA法檢測血皮質(zhì)酮水平，放免法檢測血胰島素水平。(2)腎臟指標：體重、腎重、24小時尿量：生化檢測尿蛋白、UCr、NAG、尿Na+、尿K+水平；計算肌酐清除率、

4、腎指數(shù)(腎重/體重)及24小時尿K+/Na+比率。(3)腎臟形態(tài)學觀察：取腎臟用10％中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，PAS染色，光鏡觀察腎臟顯微結(jié)構(gòu)。2.5％戊二醛固定，鋨酸后固定，常規(guī)脫水、包埋，超薄切片，電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)；(4)mRNA檢測：半定量RT-PCR方法測定大鼠腎臟組織TGF-β1、SGK1、FN、Col-Ⅳ、11β-HSD2、11β-HSD1基因的mRNA表達水平。(5)蛋白檢測：免疫組化方法測定大鼠腎臟

5、TGF-β1、FN表達水平。 結(jié)果： 1.血糖、血脂、血膚島素、血皮質(zhì)酮、BUN、血Na+、血K+水平：與正常組相比，糖尿病組血耱、血胰島素、血皮質(zhì)酮、BUN、血TC、血TG顯著升高(P＜0.01)，LDL-c升高(P＜0.05)，HDL-c下降(P＜0.05)。經(jīng)棉酚干預(yù)后，血糖、血胰島素、血皮質(zhì)酮水平較糖尿病組明顯降低(P＜0.01)，BUN、TC、TG、LDL-c水平較糖尿病組降低(P＜0.05)，HDL-c水平較

6、糖尿病組有升高趨勢，但無顯著性差異。正常組、糖尿病組、棉酚干預(yù)組三組Na+、K+水平無顯著差異。 2.體重、腎重、腎指數(shù)、24小時尿蛋白、NAG、肌酐清除率、尿K+/Na+： 與正常組相比，糖尿病組大鼠腎重、腎指數(shù)、24小時尿蛋白、24小時尿NAG明顯升高(P＜0.01)，體重顯著下降(P＜0.01)，內(nèi)生肌酐清除率下降(P＜0.05)。經(jīng)棉酚干預(yù)后，大鼠腎指數(shù)顯著降低(P＜0.01)，24小時尿NAG降低(P＜0.05

7、)，體重明顯升高(P＜0.01)。24小時尿蛋白、腎重呈下降趨勢，內(nèi)生肌酐清除率呈升高趨勢，但統(tǒng)計學上無顯著性差異。正常組、糖尿病組、棉酚干預(yù)組三組尿K+/Na+比率無顯著差異。 3.腎臟形態(tài)學觀察： 光鏡觀察：糖尿病組大鼠腎小球體積普遍增大，個別腎小球出現(xiàn)萎縮。PAS染色陽性基質(zhì)增多，主要集中在腎小球團的中心。棉酚干預(yù)后，HE染色顯示腎組織病變比糖尿病組有所減輕，PAS染色顯示陽性基質(zhì)減少。電鏡觀察：糖尿病組大鼠腎小球

8、毛細血管基底膜不規(guī)則增厚，厚薄不均勻，足細胞突起腫脹，可見足突融合。棉酚干預(yù)組大鼠基底膜基本正常，足突融合減輕。 4.腎組織的TGF-β1、SGK1、FN、Col-Ⅳ基因的mRNA表達： 與正常組比較，糖尿病組大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅳ基因mRNA表達顯著升高(P＜0.01)，SGK、FN基因mRNA表達升高(P＜0.05)。經(jīng)棉酚治療后，TGF-β1、FN、Col-Ⅳ基因mRNA表達水平降低(P＜0.05)，S

9、GK1基因mRNA表達有降低趨勢，無統(tǒng)計學差異。 5.腎組織的11β-HSD2、11β-HSD1基因的mRNA表達： 與正常組比較，糖尿病大鼠腎組織11β-HSD2mRNA表達降低(P＜0.05)，經(jīng)棉酚治療后，11β-HSD2mRNA表達水平無明顯變化。正常組、糖尿病組、棉酚組三組大鼠11β-HSD1mRNA表達水平無明顯變化。 6.腎組織TGF-β1、FN免疫組織化學結(jié)果： 在正常組大鼠腎組織，TGF

10、-β1、FN呈弱陽件表達。糖尿病組人鼠腎組織TGF-β1、FN蛋白表達明顯增強(P＜0.01)。經(jīng)棉酚干預(yù)后，TGF-β1、FN蛋白表達明顯減弱(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.棉酚可降低2型糖尿病大鼠的血糖和胰島素水平，增加胰島素敏感性，并能改善2型糖尿病大鼠的脂代謝異常。 2.2型糖尿病組大鼠腎臟組織TGF-β1、SGK1、FN、Col-ⅣmRNA及TGF-β1、FN蛋白表達升高，這可能參與了DN的發(fā)生及發(fā)展。