小檗堿通過激活A(yù)MPK及PI3K-Akt減輕糖尿病大鼠心肌缺血-再灌注損傷.pdf

1、新近流行病學(xué)研究顯示,中國糖尿病患者超過9240萬,已成為世界糖尿病第一大國,其發(fā)病率呈不斷上升趨勢。其中,心血管疾病是糖尿病患者的主要致死原因。臨床研究顯示,糖尿病患者比正常人群心肌梗死患病率和死亡率高2-5倍。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌損傷中發(fā)揮重要作用,是缺血性心肌損傷的重要表現(xiàn)之一。激活PI3K-Akt-eNOS-NO為主的“生存信號”通路可減少心肌細(xì)胞凋亡,改善心功能,最終保護(hù)缺血/再灌注心臟。
　　傳

2、統(tǒng)中藥治療糖尿病和心血管疾病有悠久歷史和較好療效。治療糖尿病的中藥復(fù)方以清熱類和補(bǔ)氣類藥物為主,其中清熱類藥物—黃連的使用頻率極高。但黃連治療糖尿病及其心血管并發(fā)癥的分子機(jī)制仍然不清。小檗堿(Berberine,BBR)為異喹啉類生物堿,是中藥黃連的主要有效成分之一,被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌性痢疾等胃腸道疾病的治療。近年研究發(fā)現(xiàn),BBR具有降低血糖,調(diào)節(jié)血脂代謝的作用。但與胰島素降血糖作用機(jī)制不同,BBR降低血糖、調(diào)節(jié)血脂代謝的機(jī)制主要與激活腺

3、苷酸活化蛋白激酶(AMPK)有關(guān)。此外,有報道顯示BBR對充血性心衰患者有心臟保護(hù)作用,但具體機(jī)制尚不清楚。BBR能否減輕糖尿病條件下心肌缺血/再灌注損傷?其主要作用機(jī)制為何?闡明BBR對糖尿病心肌缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制,可望為揭示中藥—黃連治療糖尿病及其心血管并發(fā)癥提供實驗證據(jù),并為開發(fā)相關(guān)植物藥治療糖尿病性心臟病提供新資料。
　　研究目的:
　　1.明確BBR對糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌是否具有保護(hù)作用。
　

4、　2.探討B(tài)BR發(fā)揮保護(hù)糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌的作用機(jī)制,特別是BBR是否具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用及其主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.正常3周齡雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠給予小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)聯(lián)合高糖高脂飼料飲食喂養(yǎng)8 wks,制備2型糖尿病大鼠模型。將糖尿病大鼠隨機(jī)分為4組進(jìn)行灌胃:
　　(1)糖尿病組(DM組),生理鹽水,2 mL/kg/d,i.g.;
　　(

5、2)低劑量BBR組(DM+BBR100 mg/kg/d),BBR100 mg/kg/d,i.g.;
　　(3)中劑量BBR組(DM+BBR200 mg/kg/d),BBR200 mg/kg/d,i.g.;
　　(4)高劑量BBR組(DM+BBR400 mg/kg/d),BBR400 mg/kg/d,i.g.。
　　每組10-20只,灌胃4 wks。
　　2.BBR或生理鹽水灌胃4 wks后,大鼠禁食8 h進(jìn)行糖耐

6、量試驗(OGTT)。給予大鼠葡萄糖(5 g/kg BW)灌胃后在0、30、60、120、180 min時分別采尾靜脈血,測定血糖水平。
　　3.BBR或生理鹽水灌胃4 wks后,結(jié)扎冠狀動脈左前降支構(gòu)建心臟缺血/再灌注模型(缺血30 min/再灌注3 h),并持續(xù)監(jiān)測大鼠血流動力學(xué)各指標(biāo)。再灌注結(jié)束后,制備心肌組織切片,采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位平端標(biāo)記法(TUNEL)原位定量檢測細(xì)胞凋亡。大鼠心肌缺血/再灌注實驗

7、分為5組,分別是:
　　(1)糖尿病+假手術(shù)組(DM+Sham);
　　(2)糖尿病+缺血/再灌注組(DM+I/R);
　　(3)糖尿病+缺血/再灌注+低劑量BBR組(BBR100 mg/kg/d);
　　(4)糖尿病+缺血/再灌注+中劑量BBR組(BBR200 mg/kg/d);
　　(5)糖尿病+缺血/再灌注+高劑量BBR組(BBR400 mg/kg/d)。
　　4.采用酶消化法分離、培養(yǎng)原代乳鼠

8、心肌細(xì)胞。建立乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型。原代乳鼠心肌細(xì)胞無糖無血清DMEM培養(yǎng)后置于1％O2,5%CO2,94%N2細(xì)胞培養(yǎng)箱中缺氧2 h,復(fù)氧即刻給予含不同濃度BBR的高糖培養(yǎng)液(含25 mmol/L葡萄糖)。復(fù)氧條件為常規(guī)培養(yǎng)箱(95%O2,5%CO2)培養(yǎng)2 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為:
　　(1)高糖組(25 mmol/L葡萄糖,HG);
　　(2)高糖+缺氧/復(fù)氧組(HG+H/R);
　　(3)高糖+缺氧/復(fù)氧

9、+低劑量BBR組(BBR0.5μmol/L);
　　(4)高糖+缺氧/復(fù)氧+中劑量BBR組(BBR5μmol/L);
　　(5)高糖+缺氧/復(fù)氧+高劑量BBR組(BBR50μmol/L)。
　　5.分別采用MTT法檢測心肌細(xì)胞生存率;采用Hoechst33342染色、TUNEL染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡率;收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,用NO檢測試劑盒測定NOx含量。
　　6.Western Blot檢測心肌細(xì)胞AMP

10、K、Akt、eNOS表達(dá)和活性,測定PI3K、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.灌胃4 wks后,BBR可以降低糖尿病大鼠血糖水平。OGTT實驗結(jié)果表明,與DM組相比,BBR200 mg/kg/d灌胃組和BBR400 mg/kg/d灌胃組不僅顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖水平(均為4.0±0.2 mmol/L,與DM組相比,P<0.01,n=6-15),而且顯著改善糖尿病大鼠口服葡萄糖后

11、30、60、120和180 min時血糖水平(P<0.01)。同時,BBR中劑量組顯著升高糖尿病大鼠MI/R后再灌注末期心臟± LV dP/dtmax(與DM+ I/R組相比,P<0.01,n=6-15)。該結(jié)果說明,BBR可改善糖尿病大鼠缺血/再灌注后心臟收縮和舒張功能,促進(jìn)其心臟功能恢復(fù)。此外,糖尿病大鼠缺血/再灌注后心肌細(xì)胞凋亡明顯。BBR中劑量組可以抑制糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡(P<0.05)。
　　2.為了排除

12、血糖降低對心臟的影響,進(jìn)一步明確BBR對糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌是否具有直接保護(hù)作用及其具體機(jī)制,我們采用乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型,發(fā)現(xiàn),與單純高糖組相比,HG+H/R顯著降低心肌細(xì)胞存活率(P<0.01,n=6),復(fù)氧時分別給予不同濃度的BBR(0.5μmol/L,5μmol/L和50μmol/L)可濃度依賴性提高乳鼠心肌細(xì)胞存活率。其中BBR(50μmol/L)使HG培養(yǎng)的心肌細(xì)胞H/R后存活率提高至89.3±3.5%(與HG+

13、H/R組相比,P<0.01,n=6)。同時,TUNEL染色法、Hoechst33342染色法和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均表明,HG+H/R導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡顯著增加,而BBR(50μmol/L)處理可顯著減少乳鼠心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活(P<0.01,n=6)。
　　3.為明確 BBR對糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制,我們檢測了BBR對HG+H/R時乳鼠心肌細(xì)胞NO生成的作用。結(jié)果顯示,BBR(50μmol/L)可增加HG+H

14、/R乳鼠心肌細(xì)胞NO的產(chǎn)生(P<0.05,n=6),增加心肌細(xì)胞PI3K的表達(dá)(1.6倍,與HG+H/R組相比,P<0.01),并提高Akt和eNOS的磷酸化水平(分別是2.6倍和1.7倍,與HG+H/R組相比,P<0.01)。且PI3K特異性抑制劑wortmannin可顯著抑制BBR引起的PI3K的表達(dá)增加及Akt的磷酸化水平(P<0.01,n=6)。此外,BBR(50μmol/L)還可顯著激活HG+H/R乳鼠心肌細(xì)胞AMPK,而給予

15、AMPK的特異性阻斷劑Compound C(1μmol/L)降低了BBR介導(dǎo)的AMPK磷酸化(P<0.01,n=6)。更重要的是,Compound C和wortmannin均可抑制 BBR介導(dǎo)的eNOS的磷酸化(P<0.05),并抑制心肌細(xì)胞NO生成(P<0.05,n=6)。上述結(jié)果表明BBR可分別激活PI3K/Akt和AMPK,促進(jìn)eNOS活化,增加NO生成。
　　4.Bcl-2、Bax和Caspase-3是細(xì)胞凋亡發(fā)生、發(fā)展中

16、的重要信號分子。與單純HG組相比,HG+H/R組乳鼠心肌細(xì)胞 Bcl-2/Bax的比值降低,而Caspase-3的活性升高(P<0.05,n=6)。BBR(50μmol/L)能顯著增加Bcl-2/Bax的比值(P<0.01),降低Caspase-3激活水平(P<0.05)。Compound C或wortmannin均可抑制BBR對HG+H/R乳鼠心肌細(xì)胞的抗凋亡作用,使Bcl-2/Bax的比值降低(P<0.05)及Caspase-3激活

17、水平增加(P<0.05),提示BBR的抗凋亡作用與激活 AMPK和PI3K/Akt有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.BBR可降低2型糖尿病大鼠血糖水平,增加凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值,降低Caspase-3激活,減少缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡,改善缺血/再灌注心臟收縮/舒張功能。
　　2.BBR上述心臟保護(hù)作用與其激活A(yù)MPK和PI3K/Akt促進(jìn)心肌細(xì)胞eNOS的磷酸化、增加NO生成有關(guān)。該結(jié)果也提示AMPK、Akt