miR-137靶向TNFAIP1調(diào)節(jié)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性致病機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種常見(jiàn)的老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要引起患者神經(jīng)紊亂、記憶力減退、行為和社交功能異常及認(rèn)知能力減弱，病程呈慢性進(jìn)行時(shí)，隨著病程的延長(zhǎng)，病情逐漸加重，直至完全喪失獨(dú)立生活能力。AD特征性病理變化表現(xiàn)為細(xì)胞外老年斑，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)元丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生等。盡管AD發(fā)病機(jī)制還未有明確報(bào)道，但大量研究表明β-淀粉樣(Aβ)蛋白沉積誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥及細(xì)

2、胞凋亡在AD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著十分重要的作用。
　　microRNA（簡(jiǎn)稱miRNA）是一種內(nèi)生且高度進(jìn)化的非編碼小RNA，長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸。miRNA通過(guò)與靶mRNA3'端非編碼區(qū)(UTR)發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)使mRNA降解或翻譯過(guò)程受到抑制，miRNA137位于人染色體1p22位置，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是海馬齒狀回及分子層中含量豐富，影響大腦可塑性及新生神經(jīng)元的產(chǎn)生。miRNA在許多疾病中發(fā)揮著重要作用，尤其是在腫瘤及神經(jīng)系

3、統(tǒng)疾病中意義重大，它可以通過(guò)調(diào)控神經(jīng)元的成熟誘導(dǎo)精神分裂癥的發(fā)生，同時(shí)與AD患者發(fā)病關(guān)系極為密切。腫瘤壞死因子相互作用蛋白(TNFAIP1)是第一個(gè)被鑒定的臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞中能受TNF-α和IL-6誘導(dǎo)的蛋白，屬于PDIP1家族，含有N端BTB/POZ和C端PCNA結(jié)構(gòu)域。TNFAIP1蛋白可分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在不同的組織中的表達(dá)存在差異性，是維持正常細(xì)胞生長(zhǎng)必須的。TNFAIP1蛋白結(jié)構(gòu)具有高度保守性，主要參與DNA的復(fù)制，DN

4、A修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，在AD發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用，但目前缺乏有力證據(jù)米闡述miR-137及TNFAIP1在AD發(fā)生中的致病機(jī)制。
　　目的：
　　本課題研究Aβ對(duì)miR-137及TNFAIP1表達(dá)水平的影響，并對(duì)miR-137的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)及驗(yàn)證，同時(shí)分析miR-137過(guò)表達(dá)對(duì)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的影響以及miR-137靶向結(jié)合TNFAR1抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用機(jī)制。旨在了解miR-137在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作

5、用機(jī)制，進(jìn)而為AD臨床診斷以及靶向治療提供可靠依據(jù)。
　　方法：
　　(1)設(shè)計(jì)并合成miR-137、TNFAIP1、U6、GAPDH特異性引物，將不同濃度的Aβ25-35(0，5，10，20μM)加入皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞及N2a細(xì)胞中培養(yǎng)構(gòu)建Aβ體外培養(yǎng)模型，采用qRT-PCR方法對(duì)Aβ25-35作用下細(xì)胞中miR-137及TNFAIP1mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，采用Westernblot法對(duì)TNFAIP1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。

6、
　　(2)利用生物信息學(xué)軟件分析miR-137的靶基因，構(gòu)建了pmirGLO-TNFAIP1-3'UTR-WT和pmirGLO-TNFAIP1-3'UTR-MUT重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒及miR-137共轉(zhuǎn)染到239TN細(xì)胞中，采用熒光素酶雙報(bào)告基因法檢測(cè)細(xì)胞中熒光素酶活性;采用qRT-PCR方法對(duì)miR-137轉(zhuǎn)染組、anti-miR-137轉(zhuǎn)染組、miR controls轉(zhuǎn)染組、anti-miR controls轉(zhuǎn)染組皮質(zhì)神經(jīng)

7、元及N2a細(xì)胞中TNFAIP1mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析;采用Westernblot法對(duì)不同組細(xì)胞中TNFAIP1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。
　　(3)將miR-control及miR-137轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，采用qRT-PCR測(cè)定細(xì)胞中miR-137表達(dá)水平。隨后分別在miR-control及miR-137轉(zhuǎn)染組中加入不同濃度的Aβ25-35，培養(yǎng)24h后，分別采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Caspase比色法及ELISA法測(cè)定不同轉(zhuǎn)染組及

8、不同Aβ25-35濃度作用下細(xì)胞活性，細(xì)胞凋亡率，Caspase活性及NF-□B活性的變化;采用Westernblot法對(duì)NF-□B蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。
　　(4)分別將si-control及si-TNFAIP1轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，采用Westernblot測(cè)定細(xì)胞中TNFAIP1蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量。隨后將實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(NC組)及si-control、si-TNFAIP1、miR-control、miR-137、miR-13

9、7+pcDNA3.1、miR-137+pcDNA-TNFAIP1轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞組，NC細(xì)細(xì)胞中加入PBS緩沖液，其他各組分別加入20μM的Aβ25-35，培養(yǎng)24h后，采用分別采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Caspase比色法及ELISA法測(cè)定不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活性，細(xì)胞凋亡率，Caspase活性及NF-□B活性的變化。
　　結(jié)果：
　　(1)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著Aβ25-35濃度的增加，皮質(zhì)神經(jīng)元及N2a細(xì)胞中miR-

10、137相對(duì)表達(dá)水平與未加入Aβ25-35組相比顯著降低(P＜0.05);TNFAIP1mRNA和蛋白表達(dá)水平與未加入Aβ25-35組相比顯著增加(P＜0.05)。
　　(2)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，TNFAIP1是miR-137的一個(gè)靶基因。熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-137與TNFAIP1-3'UTR-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶表達(dá)量明顯降低(P＜0.05);而miR-137與TNFAIP1-3'UTR-Mut共

11、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)量則與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-137轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-137相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P＜0.05);anti-miR-137轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-137相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，皮質(zhì)神經(jīng)元和N2a細(xì)胞中miR-137轉(zhuǎn)染組TNFAIP1mRNA和蛋白水平相對(duì)表達(dá)量與miR-control組相

12、比顯著降低（P＜0.05），anti-miR-137轉(zhuǎn)染組TNFAIP1mRNA和蛋白水平相對(duì)表達(dá)量較anti-miR-control組顯著增加(P＜0.05)。
　　(3)MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著Aβ25-35濃度的增加，兩組細(xì)胞活性均逐漸降低，但Aβ25-35濃度為10μM及20μM時(shí)，miR-137轉(zhuǎn)染組與miR-control轉(zhuǎn)染組相比細(xì)胞活性明顯較高（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)和Caspase-3比色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

13、結(jié)果顯示，隨著Aβ25-35濃度的增加，miR-137組及miR-control組細(xì)胞凋亡率及Caspase-3活性逐漸升高，但與對(duì)照組相比，miR-137組細(xì)胞凋亡率及Caspase-3活性較低(P＜0.05)。ELISA測(cè)定NF-□B活性結(jié)果顯示，隨著Aβ25-35濃度的增加，miR-137組及miR-control組NF-□B活性逐漸升高，但與對(duì)照組相比，miR-137組NF-□B活性較低(P＜0.05)。
　　(4)Wes

14、ternblot法檢測(cè)結(jié)果顯示，si-TNFAIP1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中TNFAIP1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降;pcDNA-TNFAIP1轉(zhuǎn)染組N2a細(xì)胞中TNFAIP1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，Aβ25-35作用后細(xì)胞活性明顯降低，si-TNFAIP1組與miR-137過(guò)表達(dá)組能夠逆轉(zhuǎn)Aβ25-35對(duì)細(xì)胞活性的抑制(P＜0.05)，miR-137+pcDNA-TNFAIP1組細(xì)胞活性與miR-137+pcDNA3.1組相比明

15、顯較低（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)及Caspase-3比色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況結(jié)果顯示，si-TNFAIP1組及miR-137過(guò)表達(dá)組能明顯逆轉(zhuǎn)Aβ25-35對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用（P＜0.05）;miR-137+pcDNA-TNFAIP1組細(xì)胞中胞凋亡率及Caspase-3活性與miR-137+pcDNA3.1細(xì)相比較高（P＜0.05）。ELISA測(cè)定NF-□B活性結(jié)果顯示，Aβ25-35可使NF-□B活性增強(qiáng)，si-TNFAIP1組及m

16、iR-137過(guò)表達(dá)組能明顯逆轉(zhuǎn)Aβ25-35對(duì)NF-□B活性的促進(jìn)作用(P＜0.05)，而TNFAIP1過(guò)表達(dá)可明顯解除si-TNFAIP1及miR-137對(duì)NF-□B活性的抑制作用（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　Aβ25-35能夠抑制細(xì)胞中miRNA的表達(dá)，促進(jìn)TNFAIP1的表達(dá)。TNFAIP1是miR-137的一個(gè)靶基因，miR-137過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向結(jié)合TNFAIP1激活NF-□B通路進(jìn)而抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)