miR-137增強多發(fā)性骨髓瘤細胞對地塞米松的敏感性并提高其自噬活性的機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述:
　　第一部分 miR-137作用于MITF下調(diào)AKT磷酸化增強多發(fā)性骨髓瘤細胞的地塞米松敏感性
　　目的：本實驗以人多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者及非MM患者的骨髓單個核CD138+細胞，人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226和U266細胞為研究對象，觀察miR-137在MM細胞內(nèi)的表達情況及其對MM細胞地塞米松敏感性的影響，并進一步探討其分子機制。
　　方法：用磁珠分選法分選MM患者及非MM患者的

2、骨髓單個核CD138+細胞；Taqman real-time PCR法檢測細胞內(nèi)miR-137的表達情況；雙熒光素酶報告基因法對miR-137的靶點進行驗證；慢病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染MITF-shRNA以及過表達miR-137，MITF；Real-time PCR法檢測MITF，c-MET，P53的mRNA表達變化；Western blot或免疫熒光法檢測MITF，c-MET，AKT，P53，p-AKT及其下游磷酸化蛋白的表達；MTT法和流式細

3、胞術(shù)凋亡檢測分析轉(zhuǎn)染前后MM細胞的地塞米松敏感性。
　　結(jié)果：miR-137在RPMI8226和U266細胞內(nèi)未檢測到表達，在MM患者骨髓單個核CD138+細胞的表達顯著低于非MM患者骨髓單個核CD138+細胞；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炋崾綧ITF是miR-137的一個靶點；與轉(zhuǎn)染對照載體相比，轉(zhuǎn)染miR-137或MITF-shRNA后，MITF，c-MET，p-AKT及其下游磷酸化底物蛋白表達明顯下調(diào)，AKT的表達無明顯變化，P5

4、3表達明顯上調(diào)，同時，地塞米松對MM細胞的36h抑制率及其誘導的MM細胞凋亡率均明顯上調(diào)；在轉(zhuǎn)染了miR-137的MM細胞內(nèi)過表達MITF，可以逆轉(zhuǎn)上述變化。
　　結(jié)論：miR-137可以引起MM細胞內(nèi)MITF及其下游c-MET的表達下調(diào)，進而使AKT 的磷酸化水平下調(diào)，從而提高了MM細胞對地塞米松的敏感性。
　　第二部分 miR-137作用于 MITF下調(diào) AKT磷酸化提高多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞的自噬活

5、性
　　目的：本實驗以人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞為研究對象，觀察miR-137在RPMI8226細胞內(nèi)的表達情況及其對RPMI8226細胞自噬的影響，并進一步探討其分子機制。
　　方法：用慢病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染MITF-shRNA以及過表達miR-137，MITF；Western blot法檢測MITF，c-MET，AKT，p-AKT，p-mTOR，p-Beclin1，LC3 II的表達；免疫共沉淀（co-IP）法檢測p-

6、Beclin1與14-3-3蛋白和Vimentin蛋白的結(jié)合。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染miR-137或MITF-shRNA后，AKT的表達無明顯變化，MITF，c-MET， p-AKT，p-mTOR，p-Beclin1表達明顯下調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-137或MITF-shRNA后， LC3 II在基礎(chǔ)情況下有少量增多，在饑餓誘導時顯著增多；在轉(zhuǎn)染了miR-137的MM細胞內(nèi)過表達MITF，可以逆轉(zhuǎn)miR-137的上述生物學效應(yīng)。
　　結(jié)論