組織特異的APE1siRNA載體增強(qiáng)多發(fā)性骨髓瘤化療敏感性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、 研究目的:研究APE1蛋白在MM細(xì)胞中表達(dá)情況，分析APE1表達(dá)與MM療效的關(guān)系，以確證APE1為MM治療有效的靶基因;構(gòu)建MM特異性APE1siRNA表達(dá)載體，并鑒定其對(duì)MM細(xì)胞APE1基因的特異性敲除作用;探討誘導(dǎo)APE1基因沉默對(duì)MM化療的增敏作用。 研究?jī)?nèi)容和方法:收集臨床MM患者的骨髓標(biāo)本及完整臨床病歷資料，采用免疫細(xì)胞化學(xué)、雙標(biāo)免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡和Westernblot方法檢測(cè)MM患者骨髓及MM細(xì)胞

2、株KM3中APE1蛋白的表達(dá)，并分析其表達(dá)與MM臨床分型、療效的關(guān)系。 GenBank檢索和比對(duì)APE1活性結(jié)構(gòu)域cDNA序列，篩選、設(shè)計(jì)、合成APE1siRNA相關(guān)基因片段，退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)直接插入線性化pSilencer2.0-U6質(zhì)粒，得到pSilencerAPE1siRNA。化學(xué)合成IgP序列，用EcoRI、BamHI酶切消化pSilencerAPE1siRNA質(zhì)粒后應(yīng)用T4DNA連接酶連接，得到pSilencerIgP

3、-APE1siRNA。從小鼠基因組DNA中通過PCR制備IE、K片段，給予EcoRI酶切消化pSilencerIgP-APE1siRNA，以T4DNA連接酶連接獲得pSilencerIE-IgP-APE1siRNA表達(dá)載體；再予XhoI酶切消化后者，以T4DNA連接酶連接得到MM特異的pSilencerK-IE-IgP-APE1siRNA質(zhì)粒，每次得到的質(zhì)粒均應(yīng)用酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證插入序列的正確性。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染KM3細(xì)胞，Westernb

4、lot分析驗(yàn)證siRNA阻斷APE1基因表達(dá)的量效和時(shí)效關(guān)系；選用KM3、HOS和MDA-231細(xì)胞株，應(yīng)用免疫印跡檢測(cè)pSilencerK-IE-IgP-APE1siRNA載體對(duì)MM細(xì)胞APE1基因的特異性“敲除”作用；并使用EGFP表達(dá)質(zhì)粒與其共轉(zhuǎn)染后應(yīng)用熒光顯微鏡檢測(cè)，估算RNAi質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。 應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pSilencerK-IE-IgP-APE1siRNA質(zhì)粒至KM3細(xì)胞，G418抗性篩選后獲得陽(yáng)性克隆。APE1

5、基因沉默條件下，MTT法檢測(cè)不同劑量馬發(fā)蘭作用KM3細(xì)胞存活率的改變；流式細(xì)胞儀測(cè)定馬發(fā)蘭作用對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的影響；TUNEL(TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記)法檢測(cè)KM3細(xì)胞凋亡指數(shù)。并設(shè)不同劑量IL-6作用濃度模擬骨髓造血微環(huán)境，選用MTT法、流式細(xì)胞儀測(cè)定和DNA片段化率檢測(cè)觀察APE1基因沉默對(duì)增強(qiáng)馬發(fā)蘭化療敏感性的影響。 研究結(jié)果：32例MM患者骨髓標(biāo)本APE1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為65.6％。其表達(dá)強(qiáng)度與MM療效

6、相關(guān)，即復(fù)發(fā)/難治組APE1Ⅱ級(jí)以上陽(yáng)性分度達(dá)55％，明顯高于初治組，而非腫瘤性疾病骨髓標(biāo)本未檢出Ⅱ級(jí)以上陽(yáng)性結(jié)果；MM療效還與APE1表達(dá)定位相關(guān)，胞核/胞漿聯(lián)合表達(dá)在復(fù)發(fā)/難治組明顯增高，與初治組和正常對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.01)。多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株KM3胞核/胞漿聯(lián)合高表達(dá)APE1蛋白，且其表達(dá)還與腫瘤治療相關(guān)，烷化劑馬發(fā)蘭作用可明顯誘導(dǎo)APE1表達(dá)。 通過雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了MM特異的APE1siRN

7、A表達(dá)載體。應(yīng)用脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染KM3、HOS和MDA-231細(xì)胞，免疫印跡試驗(yàn)驗(yàn)證pSilencerK-IE-IgP-APE1siRNA載體對(duì)MM細(xì)胞APE1基因具有特異性“敲除”作用，其阻斷APE1基因表達(dá)效率為80-90％。Westernblot分析表明siRNA阻斷APE1基因表達(dá)以3.0μg作用2天APE1蛋白受抑最為顯著；用熒光顯微鏡檢測(cè)EGFP表達(dá)質(zhì)粒估算RNAi質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率為38-48％。 通過雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)

8、證，成功構(gòu)建了MM特異的APE1siRNA表達(dá)載體，并通過基因轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)了siRNA在KM3多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)表達(dá)。在APE1基因沉默條件下，TUNEL法觀察到KM3絀胞有明顯的凋亡；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，凋亡效應(yīng)關(guān)系與TUNEL法結(jié)果相似；MTT法顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對(duì)化療藥物馬發(fā)蘭敏感性增加，與前一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。設(shè)不同劑量梯度IL-6模擬骨髓造血微環(huán)境，馬發(fā)蘭作用后MTT法、流式細(xì)胞儀測(cè)定和DNA片段化率檢測(cè)表明

9、，APE1siRNA處理組與對(duì)照組相比有顯著差異：KM3組、KM3Ctrl組、KM3APE1siRNA組、KM3+Mel組、KM3Ctrl+Mel組和KM3APE1siRNA+Mel組的凋亡率分別為0.51％、0.93％、1.24％、0.93％、1.32％、7.65％。 結(jié)論：MM患者存在APE1蛋白表達(dá)增高，尤以復(fù)發(fā)/難治組明顯，APE1蛋白檢測(cè)有助于MM療效及預(yù)后的判斷。 烷化劑治療后APE1蛋白表達(dá)水平明顯升高，表

10、明化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，癌細(xì)胞合成表達(dá)APE1產(chǎn)生凋亡耐受，可能是多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥的作用機(jī)制之一。 pSilencerK-IE-IgP-APE1siRNA可特異性敲除多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞APE1蛋白表達(dá)，APE1蛋白表達(dá)受抑以3.0μg作用2天最為顯著。 RNAi技術(shù)能特異性地抑制哺乳細(xì)胞基因表達(dá)，本項(xiàng)目應(yīng)用RNA干擾手段誘導(dǎo)基因沉默效率達(dá)到60-90％。 阻斷MM細(xì)胞APE1基因表達(dá)，可顯著提高M(jìn)M細(xì)