冬凌草甲素誘導人多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡和增強其被激活的Allo-PBMCs殺傷敏感性.pdf

1、研究背景與目的：
　　 多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,嚴重危害人類身體健康。目前MM的治療主要有化學治療、自體造血細胞移植和異基因造血干細胞移植等。傳統(tǒng)化療雖然能延長患者的中位生存期,但化療藥物本身對機體造成的副反應,以及患者原發(fā)/繼發(fā)耐藥等都給傳統(tǒng)化學療法的使用帶來了一定障礙。相對于傳統(tǒng)化療,大劑量化療聯合自體干細胞移植能夠延長患者中位生存期,異基因造血干細胞移植能夠發(fā)揮移植物

2、抗骨髓瘤效應,但同時異基因移植也伴隨有更高的移植物相關死亡率。因此,需尋找新的藥物和治療手段提高MM的療效。
　　 冬凌草甲素(Oridonin,Ori)是一種從植物冬凌草中提取的四環(huán)二萜類化合物,具有廣泛的生物學、藥學和病原學功效,如抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等。國內的應用表明,在食管癌、胃癌或肝癌等疾病中,Ori能夠延緩疾病進展,降低腫瘤負荷,減少并發(fā)癥同時延長患者生存期。近來研究顯示,Ori可以誘導包括前列腺癌、乳腺癌、非

3、小細胞肺癌、急性白血病(NB4、HL-60細胞)、多形性惡性膠質瘤以及人類黑素瘤在內的腫瘤細胞發(fā)生凋亡。此外,冬凌草甲素尚能延長荷淋巴細胞白血病P388細胞小鼠的生存期。盡管大量的研究均證明caspase 3、caspase 8、p53、Bcl-2/Bax、細胞色素c和核因子kappa B(NF-κB)等信號分子涉及到了Ori誘導的凋亡過程,但其對MM的抗腫瘤機制仍然未完全明了,此外,Ori的臨床應用也仍需更進一步的深入研究探討。

4、>　　 自然殺傷細胞(NK 細胞)是遺傳性免疫系統(tǒng)的主要效應細胞,對病源感染和轉化了的細胞具有自然細胞毒效應。異基因造血干細胞移植中,同種異體反應性NK細胞(Allo-reactive Natutal Killer cell,Allo-NK)能夠提升惡性血液病治愈率。NK 細胞殺傷靶細胞受HLA-KIA等抑制性信號和NKG2D配體-NKG2D等活化性信號的共同調節(jié)。但Allo-NK細胞對MM的作用尚待研究。
　　 依據MM的起

5、源、病因、發(fā)病機理等,認為冬凌草甲素將會誘導 ARH-77細胞凋亡,并推斷Ori能提升腫瘤細胞對NKG2D+細胞的殺傷敏感性。本研究以人多發(fā)性骨髓瘤 ARH-77細胞為研究對象,探討冬凌草甲素的體內、體外抗腫瘤效應。為進一步的多靶干預治療和臨床應用提供理論和實驗依據。
　　 實驗方法
　　 第一章 冬凌草甲素誘導人多發(fā)性骨髓瘤 ARH-77細胞凋亡
　　 以MTT的方法檢測不同濃度冬凌草甲素在不同時間對 ARH-

6、77細胞的抑制作用。經不同濃度Ori(0、2.5、5、10μmol/L)作用24h后觀察以下指標:采用相差顯微鏡和Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡的形態(tài)學改變；流式細胞儀檢測細胞凋亡率、細胞周期、線粒體膜電位、細胞表面TRAIL受體/Fas/FasL、細胞內活性氧簇的改變；以甲基纖維素半固體培養(yǎng)法測定ARH-77細胞在藥物干預前后的體外克隆形成能力和Ori 對人臍血單個核細胞克隆形成的影響；RT-PCR測定ARH-77細胞凋亡

7、通路調節(jié)分子Bcl-2、Bcl-x1、Bax、Bid、p53、NF-κB和β-actin的mRNA表達；分光光度法檢測caspase 8、caspase 9的變化；ELISA法檢測細胞色素c含量的變化。
　　 第二章 冬凌草甲素作用后ARH-77細胞對NKG2D+細胞殺傷敏感性的研究
　　 ARH-77細胞經5μmol/L Ori處理24h,以LDH釋放法測定Ori作用前、后ARH-77細胞對NKG2D+細胞殺傷敏感性的

8、差異；RT-PCR方法檢測活化性受體NKG2D的配體MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3在腫瘤細胞mRNA的表達；流式細胞儀測定ARH-77細胞表面NKG2D配體(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3)、Fas/FasL/TRAIL的表達狀態(tài)。
　　 第三章 冬凌草甲素對荷人多發(fā)性骨髓瘤細胞裸鼠的體內實驗研究
　　 選用Bul B/C nu/nu裸鼠為實驗動物,通過尾靜脈注射ARH-7

9、7細胞建立荷人多發(fā)性骨髓瘤 ARH-77細胞的實驗模型,以一般狀況、病理學、免疫組織化學檢測小鼠組織形態(tài)學和人特異性CD20、CD45抗原的表達,以評價實驗模型的成功建立。給予治療組小鼠腹腔注射冬凌草甲素(15mg/kg),PBS治療作為對照組,以上述指標和TUNEL法觀察藥物治療效果。
　　 統(tǒng)計學方法
　　 應用SPSS16.0軟件進行數據處理,數據以均數±標準差9((x)±s)表示,所有統(tǒng)計方法主要包括單因素方差分

10、析、獨立樣本t檢驗、析因設計的方差分析、重復測量的方差分析、Kaplan-Meier生存分析法。方差齊時組間多重比較采用SNK法,方差不齊時組間多重比較采用Dunnett's T3法,P<0.05提示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論
　　 1.冬凌草甲素能夠誘導人多發(fā)性骨髓瘤 ARH-77細胞凋亡,其誘導ARH-77細胞凋亡呈時間劑量依賴性；
　　 2.冬凌草甲素誘導ARH-77細胞凋亡是通過調節(jié)Bcl-2家族成員