白細(xì)胞介素37對(duì)天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制活性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)對(duì)于維持適度的免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。CD4+CD25+ Treg細(xì)胞結(jié)構(gòu)性表達(dá)叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)-4。上述關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)性分子缺陷時(shí)，小鼠表現(xiàn)為致死性淋巴細(xì)胞增殖表型。CD4+CD25+Treg表達(dá)Toll樣受體4(TLR4)，后者可以被脂多糖(LPS)激活，Treg細(xì)胞抑制活性隨之增強(qiáng)。Treg細(xì)胞還可以分泌抑制性細(xì)胞因子，如

2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β和白細(xì)胞介素(IL)-10，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，抑制效應(yīng)T細(xì)胞。Treg細(xì)胞自身增殖活性低下，它在體外可以抑制IL-2的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制T細(xì)胞活化。Treg細(xì)胞還可以通過(guò)細(xì)胞表面的IL-2受體，消耗效應(yīng)T細(xì)胞賴以生存的IL-2，進(jìn)而導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞凋亡。Treg細(xì)胞可以控制Th1和Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，進(jìn)而控制Th1和Th2型免疫反應(yīng)。Treg細(xì)胞對(duì)于控制膿毒癥早期的炎癥反應(yīng)有利。但是Treg細(xì)胞增多可以導(dǎo)致淋巴細(xì)

3、胞增殖受抑制，進(jìn)而導(dǎo)致膿毒癥免疫麻痹。
　　IL-37(IL-1F7)在人類細(xì)胞表達(dá)，在小鼠中不表達(dá)。但是人重組IL-37對(duì)小鼠細(xì)胞的效應(yīng)和人類細(xì)胞的效應(yīng)相似，均表現(xiàn)為下調(diào)固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)。體內(nèi)研究顯示，IL-37在多種炎癥疾病中發(fā)揮抗炎效應(yīng)。IL-37轉(zhuǎn)基因小鼠研究顯示，IL-37對(duì)內(nèi)毒素血癥、刀豆素A誘導(dǎo)的肝炎、葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎、缺血再灌注損傷均有抗炎保護(hù)效應(yīng)。新近研究顯示，IL-37在人Treg細(xì)胞表達(dá)，基因

4、敲減IL-37可以減弱Treg細(xì)胞的抑制活性。
　　研究目的：
　　1.研究IL-37對(duì)正常小鼠CD4+CD25+Treg免疫抑制活性的影響;
　　2.體外模擬膿毒癥環(huán)境，研究IL-37對(duì)LPS環(huán)境中小鼠CD4+CD25+Treg免疫抑制活性的影響;
　　3.研究IL-37對(duì)膿毒癥小鼠的生存保護(hù)效應(yīng)。
　　研究方法：
　　1.按照說(shuō)明書要求，用美天妮磁性分離儀從C57BL/6J小鼠脾臟細(xì)胞中分選CD4

5、+CD25+Treg細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD4+CD25+Treg純度;
　　2.用重組人IL-37(rhIL-37)(0～250ng/ml)刺激Treg細(xì)胞12～48h。收集細(xì)胞上清液，EHSA分析Treg細(xì)胞分泌IL-10和TGF-β1變化;部分預(yù)處理的Treg細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光染色，流式細(xì)胞術(shù)分析Treg細(xì)胞CTLA-4和Foxp3表達(dá)變化;部分預(yù)處理的Treg細(xì)胞用于抑制活性分析。IL-37預(yù)處理

6、的Treg細(xì)胞與CFSE標(biāo)記的CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)，96小時(shí)后收集上清液，ELISA檢測(cè)CD4+CD25-T細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ濃度。同時(shí)收集細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE稀釋度，檢測(cè)發(fā)生CFSE稀釋的CD4+CD25-T細(xì)胞百分比，借此分析CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞增殖程度。通過(guò)檢測(cè)上述指標(biāo)，分析IL-37刺激和Treg細(xì)胞免疫抑制活性之間的關(guān)系，
　　3.LPS(5μg/ml)預(yù)處理Treg細(xì)胞3

7、天，預(yù)處理結(jié)束前24h向培養(yǎng)基中加入不同濃度IL-37(0～250ng/ml)。預(yù)處理完畢后分析Treg細(xì)胞Foxp3/CTLA-4表達(dá)，IL-10/TGF-β分泌;Treg/CD4+CD25-T共培養(yǎng)，收集細(xì)胞上流式細(xì)胞儀，檢測(cè)Treg對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞增殖活性的抑制程度;收集共培養(yǎng)上清液，檢測(cè)IL-2、IL-4和IFN-γ分泌。通過(guò)分析上述指標(biāo)，明確LPS環(huán)境中，IL-37能否影響Treg細(xì)胞免疫抑制活性。
　　4.建立小鼠盲腸結(jié)扎

8、穿孔(CLP)模型，假手術(shù)組只分離盲腸，但不予結(jié)扎穿刺。給小鼠腹腔注射IL-37（1μg）。IL-37腹腔注射分三種方式:CLP術(shù)前2h注射、CLP術(shù)后立即注射和CLP術(shù)后2h注射。在三個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腹腔注射PBS(200μl)作為對(duì)照組處理方式。處理完畢后，觀察CLP小鼠8天生存率。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)性變量首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。多組比較

9、應(yīng)用單因素方差分析和Bonferroni檢驗(yàn)。生存率應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線分析和log rank檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　研究結(jié)果：
　　1.IL-37對(duì)CD4+CD25+Treg抑制活性的影響:IL-37預(yù)處理增強(qiáng)了CD4+CD25+Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的免疫抑制活性，100 ng/ml處理組和24h處理組效應(yīng)最明顯。LPS可以活化小鼠Treg細(xì)胞，加強(qiáng)Treg細(xì)胞免疫抑制活性。IL-37

10、預(yù)處理，可以進(jìn)一步上調(diào)LPS環(huán)境中的Treg細(xì)胞的免疫抑制活性。
　　2.IL-37對(duì)Treg細(xì)胞Foxp3/CTLA-4表達(dá)的影響:IL-37(40～250ng/ml)預(yù)處理Treg細(xì)胞24h，可以顯著增強(qiáng)Foxp3表達(dá);IL-37(100～250ng/ml)預(yù)處理Treg細(xì)胞24h，可以顯著增強(qiáng)CTLA-4表達(dá)。100 ng/mlIL-37預(yù)處理Treg細(xì)胞不同時(shí)間，24h組Treg細(xì)胞的Foxp3/CTLA-4表達(dá)上調(diào)最明顯

11、。LPS刺激上調(diào)Foxp3表達(dá)，但是對(duì)CTLA-4表達(dá)無(wú)影響。IL-37聯(lián)合LPS刺激，可以上調(diào)Treg細(xì)胞Foxp3/CTLA-4表達(dá)。
　　3.IL-37對(duì)Treg細(xì)胞IL-10/TGF-β分泌的影響:IL-37促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌TGF-β1。LPS刺激也可以加強(qiáng)TGF-β1分泌。LPS環(huán)境中，IL-37刺激可以進(jìn)一步促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌TGF-β。IL-37和LPS單獨(dú)刺激，或IL-37/LPS聯(lián)合刺激，對(duì)Treg細(xì)胞IL

12、-10分泌均無(wú)影響。
　　4.IL-37對(duì)共培養(yǎng)試驗(yàn)中CD4+CD25-T細(xì)胞分泌IL-2、IL-4和IFN-γ的影響:Treg細(xì)胞可以抑制IL-2，但是IL-37預(yù)處理不影響Treg對(duì)IL-2的抑制效應(yīng)。LPS預(yù)處理加強(qiáng)Treg細(xì)胞對(duì)IL-2的抑制效應(yīng)，LPS聯(lián)合IL-37刺激，不能進(jìn)一步上調(diào)Treg細(xì)胞對(duì)IL-2的抑制效應(yīng)。Treg細(xì)胞有效誘導(dǎo)Th2細(xì)胞極化，共培養(yǎng)試驗(yàn)中上清液IL-4/IFN-γ比例增加，提示Th2細(xì)胞增多。