吡喹酮(PZQ)衍生物對日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的生物學(xué)效應(yīng)及PZQ抗性蟲體蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、第一部分吡喹酮（PZQ）衍生物P96及DW-3-15對日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的生物學(xué)效應(yīng)觀察
　　目的：前期研究證明PZQ衍生物P96及DW-3-15具有顯著的抗日本血吸蟲成蟲及童蟲效應(yīng)，本實驗體外觀察P96及DW-3-15對日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的生物學(xué)效應(yīng)，探討P96及DW-3-15作為抗日本血吸蟲候選新藥的潛在價值。
　　方法：單性日本血吸蟲尾蚴（70±5條）感染小鼠，21天后，用半數(shù)有效致死劑量（ED50，25.

2、98 mg/kg）PZQ對小鼠進行灌胃給藥，每天一次，連續(xù)30天，停藥21天后，再給予小鼠治療劑量（200 mg/kg）PZQ，連續(xù)5天。停藥2周后肝門靜脈灌注收集蟲體，置 DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，分別加入不同濃度 PZQ、P96和DW-3-15，作用16 h（過夜）后換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每24 h體視顯微鏡下觀察、記錄一次蟲體活力和形態(tài)變化，評價誘導(dǎo)蟲體對藥物的敏感性。
　　結(jié)果：PZQ、P96和 DW-3-15體外抗

3、未誘導(dǎo)日本血吸蟲成蟲的臨界致死濃度（蟲體經(jīng)藥物作用后72 h活力降低率達90％的最低濃度）分別為14μmol/L、25μmol/L和45μmol/L。誘導(dǎo)蟲體對PZQ的敏感性顯著降低，臨界致死濃度是抗未誘導(dǎo)蟲體的8倍（112μmol/L）；而對P96的敏感性有一定的下降，臨界致死濃度是抗未誘導(dǎo)蟲體的4倍（100μmol/L）；對DW-3-15的敏感性與未誘導(dǎo)蟲體相比則沒有明顯差異，臨界致死濃度仍為45μmol/L。
　　結(jié)論：經(jīng)P

4、ZQ持續(xù)壓力誘導(dǎo)的日本血吸蟲對PZQ具有明顯抗性，與P96及DW-3-15相比存在顯著性差異（P<0.05），特別是對DW-3-15完全沒有交叉抗性；提示PZQ衍生物P96及DW-3-15抗日本血吸蟲的作用靶點與PZQ可能有一定差異，其作用機制可能不同，具有作為抗日本血吸蟲候選新藥的潛在價值，值得進一步研究。
　　第二部分鈣通道β亞單位相關(guān)作用蛋白Ahnak在日本血吸蟲中的初步研究
　　目的：通過觀察Ahnak抗體拮抗PZQ

5、體外抗日本血吸蟲成蟲生物學(xué)效應(yīng)，探討Ahnak蛋白是否是PZQ作用的重要靶分子。
　　方法：肝門靜脈灌注法收集感染小鼠體內(nèi)的日本血吸蟲成蟲，進行體外培養(yǎng)，加入不同濃度（0.3、0.6、1.2、1.8、2.4μg/ml）Ahnak抗體，預(yù)孵育不同時間（0、1、2、4 h）后，再加入PZQ，作用16 h（過夜）后換液，繼續(xù)培養(yǎng)72h，每隔24h置體視顯微鏡下觀察、記錄一次蟲體存活數(shù)量和活力分值。
　　結(jié)果：Ahnak抗體預(yù)孵育1

6、 h，濃度為1.2μg/ml和1.8μg/ml時，對PZQ有明顯拮抗作用，蟲體72 h存活率均高達80%，活力降低率分別為71.1%和64.4%，與PZQ對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其它濃度（0.3、0.6、2.4μg/ml）抗體對PZQ均無拮抗作用；抗體濃度為1.2μg/ml，預(yù)孵育時間為1 h，對PZQ有明顯拮抗作用，其它預(yù)孵育時間（0、2、4 h），抗體對PZQ均無明顯拮抗作用。
　　結(jié)論：Ahnak抗體對

7、PZQ的體外抗日本血吸蟲成蟲效應(yīng)有一定的拮抗作用，Ahnak抗體預(yù)孵育1 h，濃度為1.2μg/ml是對PZQ的最佳拮抗方案，本研究結(jié)果為“鈣通道—PZQ抗血吸蟲效應(yīng)靶點”假說提供了新的實驗依據(jù)，Ahnak蛋白在日本血吸蟲中的作用值得進一步研究。
　　第三部分日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　目的：利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法和技術(shù)分離、鑒定PZQ抗性蟲體與未誘導(dǎo)蟲體之間的差異蛋白質(zhì)，探討PZQ抗血吸蟲效應(yīng)機制及潛在靶點

8、。
　　方法：應(yīng)用PZQ抗日本血吸蟲ED50和治療劑量，使感染小鼠體內(nèi)的蟲體在持續(xù)藥物壓力下產(chǎn)生一定的抗藥性，收集抗性蟲體和未誘導(dǎo)蟲體，提取總蛋白，采用雙向凝膠電泳（2D-PAGE）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)篩選、鑒定兩種蟲體的差異表達蛋白質(zhì)。
　　結(jié)果：經(jīng)篩選、鑒定，PZQ抗性蟲體共有40種差異表達蛋白質(zhì)，其中有31種蛋白質(zhì)表達上調(diào)，6種蛋白質(zhì)表達下調(diào)，另有3種蛋白質(zhì)變化趨勢無法確定。表達上調(diào)的蛋白質(zhì)中有

9、3種為兩種蟲體共有，有28種只在PZQ抗性蟲體蛋白質(zhì)雙向凝膠上篩選得到。這些蛋白分別歸類于細胞結(jié)構(gòu)及運動相關(guān)蛋白（9種）、應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白（4種）、參與蟲體代謝的酶類（7種）、蛋白質(zhì)翻譯和結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白（5種）、離子調(diào)節(jié)蛋白（3種）和一些功能未知蛋白（12種）。
　　結(jié)論：PZQ持續(xù)壓力下可使日本血吸蟲蛋白質(zhì)水平發(fā)生明顯改變，提示PZQ持續(xù)壓力可能促進或抑制了蟲體特定基因的表達，差異表達蛋白可能與藥物作用靶點有關(guān)。
　　第四部

10、分日本血吸蟲PZQ抗性蟲體的轉(zhuǎn)錄水平分析
　　目的：通過測定日本血吸蟲PZQ抗性蟲體與未誘導(dǎo)蟲體mRNA相對表達量，分析兩者在轉(zhuǎn)錄水平的差異，并結(jié)合蛋白質(zhì)水平的差異進行綜合分析，為探索PZQ抗蟲機理、蟲體抗藥機制，研發(fā)新藥和疫苗，建立實驗基礎(chǔ)。
　　方法：收集PZQ抗性蟲體和未誘導(dǎo)蟲體，使用TRIzol法分別抽提兩種蟲體的總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)差異蛋白質(zhì)登錄號在NCBI上搜索對應(yīng)基因序列，設(shè)計引物，采用實時熒光

11、定量PCR技術(shù)對cDNA進行相對定量，進而分析兩種蟲體的轉(zhuǎn)錄水平差異。
　　結(jié)果：PZQ抗性蟲體中核糖體蛋白/大亞基和鈣調(diào)節(jié)蛋白基因的mRNA相對表達量較未誘導(dǎo)蟲體均下降，組蛋白H2A和熱休克蛋白70基因的mRNA相對表達量升高，差異均具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；而珠蛋白-3、磷酸丙糖異構(gòu)酶、真核翻譯延長因子1α2和肌球蛋白等基因的mRNA相對表達量與未誘導(dǎo)蟲體無明顯差異（P>0.05）。
　　所檢測的8種基因中有