經(jīng)鼻吸入胰島素對鏈脲佐菌素誘導的阿爾茨海默病大鼠模型的作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是導致癡呆最常見的病因，然而目前尚無有效的治療方法可以阻止或者延緩疾病的進展。在探索散發(fā)性AD的發(fā)病機理的過程中，越來越多的證據(jù)表明胰島素信號通路異常在AD發(fā)病中起著非常重要的作用。因此，以胰島素信號通路為靶向治療AD得到人們越來越多的關(guān)注。經(jīng)鼻吸入胰島素已經(jīng)被證實可以改善健康受試者和AD患者的記憶和注意力，但這種保護作用的具體機制仍待闡明。我們前期的研究

2、發(fā)現(xiàn)，給予AD轉(zhuǎn)基因小鼠（3×Tg-AD小鼠）經(jīng)鼻吸入胰島素1周后，可以改善胰島素信號通路異常，降低腦內(nèi)Aβ40(amyloid beta，Aβ)的含量。但經(jīng)鼻吸入胰島素是否能夠增加腦葡萄糖代謝，減輕神經(jīng)炎癥，改善突觸功能，降低tau蛋白的磷酸化水平，進而改善認知功能障礙，有待我們進一步探索和研究。側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素（intracerebroventricular streptozotocin-inj ected，ICV-STZ）的大

3、鼠模型，是一種被廣泛應(yīng)用的散發(fā)性AD(sporadic AD，SAD)的模型，表現(xiàn)為認知功能障礙和許多類似AD樣的病理改變?nèi)缫葝u素抵抗，腦代謝降低，神經(jīng)炎癥和tau蛋白過度磷酸化等。為了進一步研究經(jīng)鼻吸入胰島素對散發(fā)性AD的治療作用，尤其是對認知功能、腦代謝及tau磷酸化的影響，我們采用ICV-STZ大鼠模型，連續(xù)經(jīng)鼻吸入胰島素6周（2U/天）后，檢測各組大鼠的一般情況，行為學，腦葡萄糖代謝和分子生物學指標的改變，為進一步開展后期臨床試

4、驗提供堅實的理論依據(jù)。
　　研究內(nèi)容和結(jié)果:
　　1.本研究中，我們將所有的大鼠隨機分成三組:正常對照組(Con)，生理鹽水組(STZ/Sal)和胰島素組(STZ/Ins)。給藥過程中監(jiān)測三組大鼠的體重和血糖，發(fā)現(xiàn)三組大鼠血糖的變化無明顯差異，生理鹽水組和胰島素組體重較正常對照組明顯減輕。
　　2.采用曠場實驗(Open Field，OF)，物體識別實驗（Object Recognition test，ORT）和水迷宮

5、測試(Morris Water Maze，MWM)來評估三組大鼠的自主活動和認知功能。曠場實驗中，ICV-STZ大鼠在曠場內(nèi)活動經(jīng)過的距離比對照組明顯增加，表明其對環(huán)境的探究行為增加，經(jīng)鼻吸入胰島素后能降低該組大鼠的探究行為。物體識別實驗中，ICV-STZ大鼠探究新物體的時間顯著少于對照組，而胰島素組與對照組之間沒有明顯差別，表明ICV-STZ大鼠短時記憶受損。在MWM的獲得性訓練(acquisition phase)中，三組大鼠的逃避

6、潛伏期（Escape latency）和游泳速度(Swim speed)無顯著差異;而在探查測驗(probe trial)中，ICV-STZ大鼠在目標象限停留的時間和穿越原平臺的次數(shù)明顯低于對照組和胰島素組，提示胰島素能夠改善ICV-STZ大鼠的空間記憶損害。
　　3.我們用免疫印跡法檢測了經(jīng)鼻吸入胰島素對ICV-STZ大鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化的影響。結(jié)果顯示與對照組相比，ICV-STZ大鼠腦內(nèi)tau蛋白多個位點磷酸化水平升高，如

7、Ser199/202， Thr205， Ser262和Ser396，而總tau蛋白（Tau-5）表達量沒有明顯變化。經(jīng)鼻吸入胰島素能夠顯著降低上述位點的磷酸化水平。Tau蛋白的磷酸化與其激酶和磷酸酶的活性有關(guān)。為了闡明胰島素降低tau過度磷酸化的機制，我們檢測了相關(guān)的激酶和磷酸酶的表達水平。我們發(fā)現(xiàn)各組大鼠腦內(nèi)tau蛋白激酶總量無明顯差異。在ICV-STZ大鼠腦內(nèi)，糖原合成酶-3(glycogensynthase kinase-3，GS

8、K-3)、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase,MAPK/ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)的磷酸化水平

9、明顯升高。吸入胰島素能夠?qū)SK-3、ERK1/2和CaMKⅡ的磷酸化水平降低到正常組水平。蛋白磷酸酶2(PP2A)是人腦內(nèi)最重要的tau的磷酸酶。我們沒有觀察到ICV-STZ大鼠腦內(nèi)PP2A-C蛋白水平和其活性的改變，胰島素治療對其也沒有影響。這些結(jié)果表明，經(jīng)鼻吸入胰島素降低ICV-STZ大鼠腦內(nèi)過度磷酸化的tau可能是通過下調(diào)ERK1/2和CaMKⅡ的活性實現(xiàn)的。
　　4.為了研究胰島素對神經(jīng)炎癥的影響，我們檢測了三組大鼠腦內(nèi)

10、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）和離子鈣接頭分子-1(ionizedCa2+-binding adaptor molecule-1，Iba1)的表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，ICV-STZ大鼠腦內(nèi)GFAP和Iba1水平顯著增高，而胰島素能夠明顯抑制Iba1的表達。免疫組化的結(jié)果進一步印證了以上結(jié)果。
　　5.我們還檢測了三組大鼠海馬新生神經(jīng)元標記物doublecor

11、tin(DCX)和突觸前膜、突觸后膜相關(guān)蛋白水平的變化。結(jié)果顯示與對照組相比，ICV-STZ大鼠腦內(nèi)的DCX、突觸素(synaptophysin)、突觸蛋白1（synapsin1）和突觸后密度蛋白-95（PSD-95）表達水平無明顯差別。但是胰島素組的DCX水平確明顯高于對照組，此外，胰島素組的synapsin1水平高于生理鹽水組。
　　6.為了研究經(jīng)鼻吸入胰島素對腦胰島素信號通路的影響，我們檢測了通路上相關(guān)蛋白的表達水平和活性。

12、我們發(fā)現(xiàn)ICV-STZ大鼠腦內(nèi)IRS1和AKT pT308水平明顯升高，說明ICV-STZ大鼠腦內(nèi)存在一定的胰島素信號通路異常。吸入胰島素使ICV-STZ大鼠海馬內(nèi)升高的AKT pT308水平恢復到正常水平。
　　7.腦葡萄糖代謝降低是AD的一個重要的病理生理特征。為了評估經(jīng)鼻吸入胰島素是否會影響ICV-STZ大鼠的腦葡萄糖代謝，我們應(yīng)用microPET檢測了大鼠腦內(nèi)18F-氟脫氧葡萄糖(18F-FDG)的標準化攝取值(SUVs)

13、。結(jié)果顯示，與對照組相比，注射側(cè)ICV-STZ大鼠前額葉皮層、扣帶回、紋狀體、海馬和內(nèi)嗅皮層18F-FDG SUVs明顯降低。經(jīng)鼻吸入胰島素能夠明顯增加ICV-STZ大鼠前額葉皮層和扣帶回的8F-FDG SUVs。為了研究胰島素對各腦區(qū)神經(jīng)元的影響，接下來我們用免疫組化方法檢測了神經(jīng)元標記物—NeuN在各腦區(qū)的表達。結(jié)果顯示ICV-STZ大鼠海馬的CA1、CA3區(qū)和紋狀體的陽性細胞數(shù)較對照組顯著減少。經(jīng)鼻吸入胰島素增加了ICV-STZ大

14、鼠海馬的CA1、CA3區(qū)的NeuN陽性細胞數(shù)，提示胰島素可以阻止ICV-STZ大鼠海馬內(nèi)的神經(jīng)元丟失。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)ICV-STZ大鼠存在認知功能障礙，tau過度磷酸化，神經(jīng)炎癥。此外，我們還發(fā)現(xiàn)注射側(cè)ICV-STZ大鼠前額葉皮層、扣帶回、紋狀體、海馬和內(nèi)嗅皮層葡萄糖代謝顯著降低。經(jīng)鼻吸入胰島素6周可以明顯改善ICV-STZ大鼠的認知功能，減輕腦內(nèi)tau蛋白的過度磷酸化和小膠質(zhì)細胞激活，增加海馬內(nèi)新生神經(jīng)元生成