縫隙連接蛋白43類似物(Gap26)對新生大鼠腦缺血缺氧損傷的保護作用及機制的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分 Gap26對新生大鼠腦缺血缺氧損傷的保護作用
  目的:1、觀察新生大鼠缺血缺氧損傷后縫隙連接蛋白43(Cx43)1周內的含量變化;
  2、觀察Gap26對新生大鼠腦缺血缺氧損傷是否具有保護作用。
  方法:出生7天的SD大鼠隨機分為假手術(Sham)組、假手術+Gap26(Sham+Gap26)組、缺血缺氧(HI)組和缺血缺氧+Gap26(HI+Gap26)組,建立新生大鼠缺血缺氧(the hypoxia

2、/ischemia model,HI)模型,取缺血損傷側腦組織為標本,采用Western blot法測定缺血缺氧1周內Cx43蛋白的表達;觀察缺氧前1小時給予Gap26(不同給藥劑量)處理對新生大鼠腦梗死體積的影響以及缺血缺氧后連續(xù)給藥1周對新生大鼠遠期神經行為功能的影響。
  結果:1、Cx43在缺血缺氧4小時后開始增加,在8小時后明顯增加,并隨著時間的延長持續(xù)增加;在缺血缺氧后1周,Cx43含量相對于假手術組增加了18倍左右。

3、
  2、與手術組相比,經Gap26處理后大鼠的腦梗死體積明顯減小,神經行為功能明顯增強。缺氧前1小時腹腔預給予Gap2625μg/kg,48小時后腦梗塞體積減小了24.56%;且該神經保護作用具有劑量依賴性。另一Cx43類似物Gap27(25μg/kg)預處理,相對于手術組同樣減少腦梗塞體積26.21%左右。缺血缺氧后連續(xù)給藥1周,分別于第2、3、4周進行前爪抓握實驗和足錯誤實驗,第4周進行水迷宮實驗,給藥組大鼠的抓握能力、平衡

4、能力以及學習記憶功能明顯優(yōu)于手術組,各項神經行為學指標具有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.05);4周后給藥組大鼠的半腦損失量明顯低于手術組(P<0.05)。
  結論:1、新生大鼠缺血缺氧后,腦組織Cx43含量明顯增加,并且存在時間依賴性。說明Cx43蛋白含量在新生大鼠缺血缺氧早期(24小時)及晚期(24小時后)的病理生理學變化中均起到重要的作用。
  2、使用Gap26干預新生大鼠HI模型,大鼠的腦梗死體積明顯減小,遠期神經行為

5、功能缺損明顯減輕。這些均提示Gap26對新生大鼠腦缺血缺氧損傷具有神經保護作用。
  第二部分 Gap26對新生大鼠腦缺血缺氧損傷的保護機制
  目的:1、觀察Gap26對新生大鼠缺血缺氧損傷后腦組織內凋亡相關蛋白caspase-3表達、細胞外谷氨酸含量、星形膠質細胞的激活狀態(tài)的影響;
  2、研究Gap26對新生大鼠及元代星形膠質細胞缺氧損傷后Cx43的過量表達的影響以及兩者相互作用的相關分子機制。
  方法:

6、1、將出生7天的SD大鼠隨機分為假手術(Sham)組、假手術+Gap26(Sham+Gap26)組、缺血缺氧(HI)組和缺血缺氧+Gap26(HI+Gap26)組,建立HI模型,取缺血損傷側腦組織為標本:采用Western blot法檢測Cx43、GFAP、Cleaved Caspase-3的表達;采用微透析方法提取新生大鼠活體腦組織細胞外液,利用高效液相色譜法(HPLC)測定腦組織及其細胞外透析液中谷氨酸的含量;采用免疫共沉淀法檢測腦

7、組織勻漿中的Cx43與生物素(biotin)標記的Gap26有無相互作用關系;采用免疫熒光染色法觀察各實驗組腦組織冰凍切片星形膠質細胞的激活、Cx43的表達以及biotin-Gap26與Cx43定位關系。
  2、將出生2天的SD大鼠取元代星形膠質細胞種板,隨機分為對照(Con)組、對照+Gap26(Con+Gap26)組、氧糖剝奪(OGD)組和氧糖剝奪+Gap26(OGD+Gap26)組,制作細胞氧糖剝奪(OGD)模型,觀察缺氧

8、前給予Gap26處理對星形膠質細胞缺氧損傷的影響:通過Westwen blot法檢測星形膠質細胞缺氧損傷后各實驗組不同時間點不同處理方法下Cx43、Akt、p-Akt的表達水平;利用交聯(lián)劑BS3標記細胞膜表面蛋白;采用免疫熒光染色法觀察細胞爬片上星形膠質細胞biotin-Gap26與Cx43定位關系;采用MTT方法檢測各實驗組星形膠質細胞活力;采用免疫共沉淀法檢測各實驗組泛素化Cx43的含量。
  結果:1、Gap26明顯降低腦缺

9、血損傷后Cx43、GFAP和Cleaved Caspase-3的過量表達(P<0.05),減少缺血損傷側腦組織及其細胞外液谷氨酸的含量(P<0.05);熒光染色顯示Gap26抑制HI組星形膠質細胞過度激活以及Cx43的過量表達,Cx43與biotin-Gap26在腦組織有共定位關系;免疫共沉淀法檢測腦組織勻漿中的Cx43與biotin-Gap26有相互作用關系,而作為對照組的biotin-P5則與Cx43沒有相關性。
  2、Cx

10、43與biotin-Gap26在星形膠質細胞存在共定位關系;Gap26/Gap27明顯降低Cx43的表達(P<0.05),同樣可以減少小分子Cx43在OGD損傷后的過量表達,但對細胞膜表面和胞漿的Cx43具有不同的作用;Gap26顯著升高OGD損傷后p-Akt的表達以及泛素化Cx43的含量(P<0.05),PI3K特異性抑制劑LY294002、蛋白酶體抑制劑MG132以及溶酶體抑制劑氯喹均能在不同程度上抑制Cx43的降解以及PI3K/A

11、kt通路的激活,降低Gap26對細胞的保護作用,以LY294002、MG132作用為著(P<0.05);免疫共沉淀結果顯示LY294002部分抑制了Cx43的泛素化水平。
  結論:
  1、Gap26對新生大鼠缺血缺氧損傷的神經保護作用的機制與抑制細胞外毒性水平的谷氨酸的釋放、抑制星形膠質細胞的過度激活、抑制細胞凋亡有關。
  2、Gap26主要通過泛素-蛋白酶體途徑降解缺血缺氧損傷后過度表達的Cx43,這種作用依賴

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