膿毒癥休克大鼠心肌中蘭尼堿受體的表達(dá)變化.pdf

1、目的:
　　膿毒癥(sepsis)是由感染引起的失調(diào)的宿主反應(yīng)，可造成危及生命的器官功能障礙，也是誘發(fā)膿毒癥性休克、多器官功能障礙綜合征的重要原因。心臟作為膿毒癥所致的多器官功能障礙的主要靶器官之一，常有不同程度功能障礙，而心功能障礙使得膿毒癥進(jìn)一步惡化，稱為膿毒性心肌病。膿毒癥嚴(yán)重程度及病死率與心功能障礙程度密切相關(guān)，心肌損害出現(xiàn)的越早，患者的病情越重，一旦出現(xiàn)心血管并發(fā)癥，患者病情就會(huì)急劇惡化，心功能障礙是嚴(yán)重膿毒癥以及感染性

2、休克患者的主要死因。膿毒癥時(shí)心肌功能障礙的可能機(jī)制，主要包括:
　　(1)破壞線粒體的氧化磷酸化，心肌細(xì)胞缺氧、氧化磷酸化脫偶聯(lián)、細(xì)胞產(chǎn)生高能磷酸鹽的能力降低;
　　(2)細(xì)菌內(nèi)毒素的直接心肌毒性;
　　(3)“心肌冬眠”（膿毒癥的關(guān)鍵是不能利用ATP，而心肌冬眠是一種適應(yīng)性反應(yīng)，減少心輸出量和降低耗氧，來維持ATP水平的穩(wěn)定，對(duì)心力衰竭做出適應(yīng)性反應(yīng)）;
　　(4)一氧化氮(N0)、一氧化氮合酶(NOS)持續(xù)表

3、達(dá)降低心肌收縮力引起心血管功能障礙;
　　(5)鈣離子通道變化可導(dǎo)致鈣離子漏等現(xiàn)象引起心力衰竭。
　　蘭尼堿受體(Ryanodine Receport，RyR)是一種大分子復(fù)合物，由肌漿網(wǎng)中調(diào)節(jié)Ca2+釋放的約5000個(gè)Ca2+通道殘基組合而成，因?yàn)樗捅环Q為蘭尼堿的一種植物堿具有很高特異性，由此得名。蘭尼堿受體對(duì)于肌肉和心臟的節(jié)律和收縮是必不可少的一部分，它參與調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)(Sarcoplasmic Reticulum，SR

4、)釋放Ca2+，肌漿網(wǎng)常受四個(gè)因素調(diào)節(jié)作用:
　　(1)L型鈣離子通道;
　　(2)SR蘭尼堿受體;
　　(3)肌漿網(wǎng)鈣泵;
　　(4)細(xì)胞膜鈉離子鈣離子交換。
　　蘭尼堿受體2主要分布在心臟是心臟中調(diào)節(jié)Ca2+釋放的主要通道之一，由同源四聚體形成，有一個(gè)大的細(xì)胞質(zhì)組件和跨膜域組成孔隙區(qū)域。Ca2+被認(rèn)為是心臟收縮過程中最重要的因素，心臟收縮是通過由RyR2介導(dǎo)的SR中的Ca2+釋放引起。在正常心肌收縮情況

5、下，RyR2被細(xì)胞溶質(zhì)中的Ca2+激活，每次心臟搏動(dòng)Ca2+從細(xì)胞外通過L型鈣通道進(jìn)入胞質(zhì)，然后激發(fā)RyR2釋放Ca2+。心力衰竭時(shí)，交感神經(jīng)活動(dòng)增加，通過使交感腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)興奮，腎上腺素信號(hào)通路激活，繼而兒茶酚胺水平顯著增加，高濃度兒茶酚胺慢性刺激使cAMP依賴的蛋白激酶A(Proteine Kinase A，PKA)或/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin Dependent Protein KinaseⅡ，CaMK

6、Ⅱ)對(duì)RyR2高度磷酸化，激活RyR2通道，產(chǎn)生肌漿網(wǎng)Ca2+漏，有大量證據(jù)表明，大分通道重塑和翻譯后修飾的改變，是肌漿網(wǎng)Ca2+漏增加的基礎(chǔ)。持久性的肌漿網(wǎng)Ca2+漏會(huì)導(dǎo)致肌漿網(wǎng)Ca2+負(fù)荷下降，致使肌漿網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存減少以及心臟收縮偶聯(lián)降低，從而抑制肌漿網(wǎng)Ca2+釋放和收縮過程。嚴(yán)重的肌漿網(wǎng)Ca2+漏將導(dǎo)致心力衰竭，病死率上升。
　　近年來關(guān)于蘭尼堿受體的作用以及在心肌損傷中的變化一直受到很多關(guān)注。蘭尼堿受體變化是導(dǎo)致心功能下

7、降的重要因素。目前大量的研究都是基于RyR2復(fù)合體對(duì)于多種蛋白的相互影響，對(duì)于心臟收縮力的影響，以及可能潛在引起的心臟疾病。已經(jīng)有研究表明，慢性心衰時(shí)，蘭尼堿受體隨時(shí)間的延長(zhǎng)是處于下降的趨勢(shì)，而其中蘭尼堿受體的磷酸化水平處于持續(xù)上升水平。膿毒癥時(shí)蘭尼堿受體表達(dá)變化以及與膿毒癥心功能障礙關(guān)系鮮有報(bào)道。我們推測(cè)膿毒癥休克時(shí)會(huì)有蘭尼堿受體表達(dá)降低，參與了膿毒癥心功能障礙的發(fā)生發(fā)展過程。本實(shí)驗(yàn)在膿毒性休克的特定條件下，隨病程的進(jìn)展動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了Ry

8、R2總量變化以及其磷酸化水平在心功能下降的過程中的表達(dá)的變化情況。我們的課題組前期已經(jīng)經(jīng)過大量研究證明，膿毒性休克后發(fā)生的心肌損害會(huì)導(dǎo)致心功能下降，誘發(fā)或加重休克。為了進(jìn)一步明確這種心肌損害的機(jī)制，本研究采用膿毒性休克大鼠模型，觀察不同程度心功能障礙時(shí)，心肌收縮舒張功能的變化情況、心肌組織的病理變化、心肌蘭尼堿受體2的基因及蛋白表達(dá)水平，探討膿毒性休克時(shí)心肌蘭尼堿受體與心功能變化的關(guān)系。
　　研究方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

9、與膿毒性休克模型建立
　　將大鼠用隨機(jī)數(shù)字法分為膿毒性休克組與對(duì)照組，膿毒性休克組與對(duì)照組又依不同時(shí)間分為4組0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)，每組6只，膿毒性休克組在大鼠休克后開始計(jì)時(shí)，對(duì)照組給予烏拉坦麻醉后待血壓穩(wěn)定后開始計(jì)時(shí)。予大鼠20％的烏拉垣溶液5ml/kg腹腔注射麻醉。實(shí)驗(yàn)組采用股靜脈注射LPS20mg/kg，約5分鐘緩慢注射，復(fù)制膿毒性休克模型。對(duì)照組注射同等量生理鹽水。大鼠麻醉后仰臥，四肢拉直固定，剪去頸部、大腿及腹

10、股溝的毛，靠近大腿左側(cè)腹股溝處，剪開皮膚，逐層鈍性分離組織和肌肉，注意股靜脈、股動(dòng)脈、股神經(jīng)共同行走于動(dòng)脈鞘內(nèi)，打開包膜后可見鮮紅股動(dòng)脈，予股動(dòng)脈置管，通過三通頭連接生理記錄儀(泰盟BL-420F)，采集生理信號(hào)，通過系統(tǒng)監(jiān)測(cè)大鼠血壓，監(jiān)測(cè)大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP)，以MAP值比基礎(chǔ)值下降25％-30％為休克標(biāo)準(zhǔn)。予大鼠頸動(dòng)脈、股動(dòng)脈、股靜脈插管，頸動(dòng)脈、股動(dòng)脈導(dǎo)管另一端通過三通頭與生理記錄儀（泰能BL-420L）連接，通過生理信號(hào)采集處

11、理系統(tǒng)，以軟件記錄左室舒張末壓(LVEDP)、收縮期左室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dtmax)、舒張期左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dtmax)，LVEDP上升、+dp/dtmax和-dp/dtmax下降說明大鼠心肌順應(yīng)性降低、心肌收縮力下降。檢測(cè)大鼠股動(dòng)脈血壓變化，記錄休克時(shí)間點(diǎn)。
　　2、標(biāo)本的采集及制備
　　在大鼠達(dá)到實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后，先迅速打開腹腔，分離腹主動(dòng)脈，采集3ml腹主動(dòng)脈血，在玻璃管中離心分離血清，移入-2

12、0℃保存。迅速打開胸腔，嚴(yán)格無菌取心臟，置于4℃生理鹽水中，以便于排盡心臟內(nèi)殘余血液，分離右心室、右心房以及左心房，留取左室心肌，將左室心肌切取兩部分，一部分用40 g/L多聚甲醛固定留作HE染色、免疫組化備用;一部分置于低溫凍存管中液氮保存，后移入-80℃低溫冰箱保存作Real-time PCR備用。
　　3、各組大鼠的心肌病理學(xué)檢查
　　取出各組40g/L多聚甲醛固定的心肌組織，進(jìn)行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染

13、色。在光鏡下觀察各組心肌細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)和心肌壞死情況，每張心肌組織切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野。
　　4、免疫組化檢測(cè)各組大鼠RyR2表達(dá)情況
　　取出各組40 g/L多聚甲醛固定的心肌組織，進(jìn)行石蠟包埋、切片、組化前準(zhǔn)備、血清封閉、加一抗RyR2(1∶100)、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、封片劑封片，光鏡下觀察各組心肌細(xì)胞。用醫(yī)學(xué)分析軟件Image Pro Plus6.0測(cè)量照片面積和累積光密度(IOD)并計(jì)算，用SPS

14、S軟件分析數(shù)據(jù)。
　　5、Realtime-PCR檢測(cè)各組大鼠心肌RyR2mRNA表達(dá)水平
　　取出-80℃冷凍保存的心肌組織，在EP管中加入50mg組織與1mlTrizol剪碎心肌組織提取細(xì)胞沉淀中的總RNA，所得總RNA通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)RNA的完整性和純度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度及純度，構(gòu)建大鼠RyR2mRNA引物及熒光探針，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴(kuò)增前新鮮稀釋陽性模板，取不同梯度上機(jī)，繪

15、制熒光定量RT-PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，熒光定量PCR儀自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果，得出每微克總RNA中待測(cè)mRNA的拷貝數(shù)。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SSPS12.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以(x)±s表示，同組不同時(shí)間點(diǎn)采用單因素方差分析，兩組比較采在方差齊情況下用T檢驗(yàn)（若方差不齊用K個(gè)樣本獨(dú)立檢驗(yàn)）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、膿毒性休克大鼠模型建立
　　膿毒性休克

16、組大鼠在給予LPS后血壓會(huì)出現(xiàn)暫時(shí)下降，穩(wěn)定之后會(huì)有所上升，在給藥后2小時(shí)左右，平均動(dòng)脈壓比基礎(chǔ)值下降25％-30％，為膿毒性休克，此時(shí)可觀察到大鼠四肢末梢發(fā)紺的現(xiàn)象。生理記錄儀觀察MAP血壓變化，對(duì)照組與膿毒性休克組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)與0h的基礎(chǔ)值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。膿毒性休克組大鼠各時(shí)間點(diǎn)MAP與休克0h比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，可以說明此方法制作膿毒性休克模型，給

17、藥2小時(shí)左右成模并具有穩(wěn)定性，
　　2、各組大鼠心功能改變結(jié)果
　　2.1.左室舒張末壓變化
　　動(dòng)態(tài)檢測(cè)大鼠左心功能，可發(fā)現(xiàn)膿毒性休克大鼠心功能障礙逐漸加重。休克組大鼠左室舒張末壓(LVEDP)隨休克時(shí)間的延長(zhǎng)有上升趨勢(shì)。對(duì)照組大鼠LVEDP隨插管時(shí)間變化波動(dòng)不大。休克組各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組對(duì)應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。休克組各時(shí)間點(diǎn)與休克0h組LVEDP比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照組各時(shí)

18、間點(diǎn)與0h組LVEDP比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.2.左心室內(nèi)壓改變速率變化
　　觀察大鼠收縮期左心室收縮內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dt max)和舒張期左心室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dt max)。發(fā)現(xiàn)休克大鼠+dp/dt max和-dp/dt max隨休克時(shí)間延長(zhǎng)明顯下降，同組不同時(shí)間點(diǎn)與基礎(chǔ)值比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。對(duì)照組大鼠+dp/dt max和-dp/dt max隨插管時(shí)間變化

19、波動(dòng)不大，同組不同時(shí)間點(diǎn)與基礎(chǔ)值比較均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。休克組+dp/dt max和-dp/dt max各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組對(duì)應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　3、大鼠心功能改變時(shí)心臟組織病理學(xué)變化
　　在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織的心肌結(jié)構(gòu)以及心肌細(xì)胞形態(tài)。對(duì)照組、休克0h組心肌結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞形態(tài)也未見明顯異常。休克2h、4h、6h隨著休克時(shí)間延長(zhǎng)，心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，休克6H可明

20、顯觀察到肌間組織斷裂，心肌細(xì)胞崩解，細(xì)胞核溶解。
　　4、大鼠心肌組織中RyR2免疫組織化學(xué)定位、總量表達(dá)水平及磷酸化變化及隨心功能變化的改變
　　免疫組化結(jié)果顯示，大鼠心肌組織RyR2主要定位于心肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)。對(duì)照組染色較少，膿毒性休克各個(gè)時(shí)間點(diǎn)心肌組織內(nèi)RyR2的相對(duì)蛋白表達(dá)水平除6h組明顯高于對(duì)照組相對(duì)應(yīng)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（P均＜0.01）。膿毒癥休克后隨LPS給藥時(shí)間延長(zhǎng)RyR2的蛋白表達(dá)水平逐漸下降趨勢(shì)(P＜0.01)。

21、對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)與基礎(chǔ)值比較化蛋白表達(dá)水平略微上升(P＜0.05)。RYR2磷酸化水平隨休克時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升(P均＜0.01）。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)與基礎(chǔ)值比較化蛋白表達(dá)未見明顯改變(P＞0.05)。
　　5、大鼠心肌組織中RyR2 mRNA表達(dá)隨心功能變化的改變
　　與膿毒癥時(shí)RyR2水平變化趨勢(shì)不同，膿毒癥休克0h、2h、4h RYR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于休克6h組(P＜0.01)。RyR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在大

22、鼠休克0h達(dá)到高峰，隨著休克時(shí)間的延長(zhǎng)RyR2 mRNA的表達(dá)水平逐漸下降。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)與基礎(chǔ)值比較mRNA表達(dá)水平略微上升但并未見明顯差異(P＞0.05)。膿毒癥休克各時(shí)間點(diǎn)（除6h組）mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組相對(duì)應(yīng)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（P均＜0.01），6h組mRNA表達(dá)水平休克組與對(duì)照組未見明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、本研究通過靜脈注射LPS的方法成功建立膿毒性休克大鼠模型，且隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，心肌