膿毒癥休克大鼠心肌中蘭尼堿受體的表達變化.pdf

1、目的:
　　膿毒癥(sepsis)是由感染引起的失調(diào)的宿主反應(yīng)，可造成危及生命的器官功能障礙，也是誘發(fā)膿毒癥性休克、多器官功能障礙綜合征的重要原因。心臟作為膿毒癥所致的多器官功能障礙的主要靶器官之一，常有不同程度功能障礙，而心功能障礙使得膿毒癥進一步惡化，稱為膿毒性心肌病。膿毒癥嚴重程度及病死率與心功能障礙程度密切相關(guān)，心肌損害出現(xiàn)的越早，患者的病情越重，一旦出現(xiàn)心血管并發(fā)癥，患者病情就會急劇惡化，心功能障礙是嚴重膿毒癥以及感染性

2、休克患者的主要死因。膿毒癥時心肌功能障礙的可能機制，主要包括:
　　(1)破壞線粒體的氧化磷酸化，心肌細胞缺氧、氧化磷酸化脫偶聯(lián)、細胞產(chǎn)生高能磷酸鹽的能力降低;
　　(2)細菌內(nèi)毒素的直接心肌毒性;
　　(3)“心肌冬眠”（膿毒癥的關(guān)鍵是不能利用ATP，而心肌冬眠是一種適應(yīng)性反應(yīng)，減少心輸出量和降低耗氧，來維持ATP水平的穩(wěn)定，對心力衰竭做出適應(yīng)性反應(yīng)）;
　　(4)一氧化氮(N0)、一氧化氮合酶(NOS)持續(xù)表

3、達降低心肌收縮力引起心血管功能障礙;
　　(5)鈣離子通道變化可導(dǎo)致鈣離子漏等現(xiàn)象引起心力衰竭。
　　蘭尼堿受體(Ryanodine Receport，RyR)是一種大分子復(fù)合物，由肌漿網(wǎng)中調(diào)節(jié)Ca2+釋放的約5000個Ca2+通道殘基組合而成，因為它和被稱為蘭尼堿的一種植物堿具有很高特異性，由此得名。蘭尼堿受體對于肌肉和心臟的節(jié)律和收縮是必不可少的一部分，它參與調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)(Sarcoplasmic Reticulum，SR

4、)釋放Ca2+，肌漿網(wǎng)常受四個因素調(diào)節(jié)作用:
　　(1)L型鈣離子通道;
　　(2)SR蘭尼堿受體;
　　(3)肌漿網(wǎng)鈣泵;
　　(4)細胞膜鈉離子鈣離子交換。
　　蘭尼堿受體2主要分布在心臟是心臟中調(diào)節(jié)Ca2+釋放的主要通道之一，由同源四聚體形成，有一個大的細胞質(zhì)組件和跨膜域組成孔隙區(qū)域。Ca2+被認為是心臟收縮過程中最重要的因素，心臟收縮是通過由RyR2介導(dǎo)的SR中的Ca2+釋放引起。在正常心肌收縮情況

5、下，RyR2被細胞溶質(zhì)中的Ca2+激活，每次心臟搏動Ca2+從細胞外通過L型鈣通道進入胞質(zhì)，然后激發(fā)RyR2釋放Ca2+。心力衰竭時，交感神經(jīng)活動增加，通過使交感腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)興奮，腎上腺素信號通路激活，繼而兒茶酚胺水平顯著增加，高濃度兒茶酚胺慢性刺激使cAMP依賴的蛋白激酶A(Proteine Kinase A，PKA)或/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin Dependent Protein KinaseⅡ，CaMK

6、Ⅱ)對RyR2高度磷酸化，激活RyR2通道，產(chǎn)生肌漿網(wǎng)Ca2+漏，有大量證據(jù)表明，大分通道重塑和翻譯后修飾的改變，是肌漿網(wǎng)Ca2+漏增加的基礎(chǔ)。持久性的肌漿網(wǎng)Ca2+漏會導(dǎo)致肌漿網(wǎng)Ca2+負荷下降，致使肌漿網(wǎng)Ca2+儲存減少以及心臟收縮偶聯(lián)降低，從而抑制肌漿網(wǎng)Ca2+釋放和收縮過程。嚴重的肌漿網(wǎng)Ca2+漏將導(dǎo)致心力衰竭，病死率上升。
　　近年來關(guān)于蘭尼堿受體的作用以及在心肌損傷中的變化一直受到很多關(guān)注。蘭尼堿受體變化是導(dǎo)致心功能下

7、降的重要因素。目前大量的研究都是基于RyR2復(fù)合體對于多種蛋白的相互影響，對于心臟收縮力的影響，以及可能潛在引起的心臟疾病。已經(jīng)有研究表明，慢性心衰時，蘭尼堿受體隨時間的延長是處于下降的趨勢，而其中蘭尼堿受體的磷酸化水平處于持續(xù)上升水平。膿毒癥時蘭尼堿受體表達變化以及與膿毒癥心功能障礙關(guān)系鮮有報道。我們推測膿毒癥休克時會有蘭尼堿受體表達降低，參與了膿毒癥心功能障礙的發(fā)生發(fā)展過程。本實驗在膿毒性休克的特定條件下，隨病程的進展動態(tài)監(jiān)測了Ry

8、R2總量變化以及其磷酸化水平在心功能下降的過程中的表達的變化情況。我們的課題組前期已經(jīng)經(jīng)過大量研究證明，膿毒性休克后發(fā)生的心肌損害會導(dǎo)致心功能下降，誘發(fā)或加重休克。為了進一步明確這種心肌損害的機制，本研究采用膿毒性休克大鼠模型，觀察不同程度心功能障礙時，心肌收縮舒張功能的變化情況、心肌組織的病理變化、心肌蘭尼堿受體2的基因及蛋白表達水平，探討膿毒性休克時心肌蘭尼堿受體與心功能變化的關(guān)系。
　　研究方法:
　　1、實驗動物分組

9、與膿毒性休克模型建立
　　將大鼠用隨機數(shù)字法分為膿毒性休克組與對照組，膿毒性休克組與對照組又依不同時間分為4組0小時、2小時、4小時、6小時，每組6只，膿毒性休克組在大鼠休克后開始計時，對照組給予烏拉坦麻醉后待血壓穩(wěn)定后開始計時。予大鼠20％的烏拉垣溶液5ml/kg腹腔注射麻醉。實驗組采用股靜脈注射LPS20mg/kg，約5分鐘緩慢注射，復(fù)制膿毒性休克模型。對照組注射同等量生理鹽水。大鼠麻醉后仰臥，四肢拉直固定，剪去頸部、大腿及腹

10、股溝的毛，靠近大腿左側(cè)腹股溝處，剪開皮膚，逐層鈍性分離組織和肌肉，注意股靜脈、股動脈、股神經(jīng)共同行走于動脈鞘內(nèi)，打開包膜后可見鮮紅股動脈，予股動脈置管，通過三通頭連接生理記錄儀(泰盟BL-420F)，采集生理信號，通過系統(tǒng)監(jiān)測大鼠血壓，監(jiān)測大鼠平均動脈壓(MAP)，以MAP值比基礎(chǔ)值下降25％-30％為休克標準。予大鼠頸動脈、股動脈、股靜脈插管，頸動脈、股動脈導(dǎo)管另一端通過三通頭與生理記錄儀（泰能BL-420L）連接，通過生理信號采集處

11、理系統(tǒng)，以軟件記錄左室舒張末壓(LVEDP)、收縮期左室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dtmax)、舒張期左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dtmax)，LVEDP上升、+dp/dtmax和-dp/dtmax下降說明大鼠心肌順應(yīng)性降低、心肌收縮力下降。檢測大鼠股動脈血壓變化，記錄休克時間點。
　　2、標本的采集及制備
　　在大鼠達到實驗對應(yīng)時間點后，先迅速打開腹腔，分離腹主動脈，采集3ml腹主動脈血，在玻璃管中離心分離血清，移入-2

12、0℃保存。迅速打開胸腔，嚴格無菌取心臟，置于4℃生理鹽水中，以便于排盡心臟內(nèi)殘余血液，分離右心室、右心房以及左心房，留取左室心肌，將左室心肌切取兩部分，一部分用40 g/L多聚甲醛固定留作HE染色、免疫組化備用;一部分置于低溫凍存管中液氮保存，后移入-80℃低溫冰箱保存作Real-time PCR備用。
　　3、各組大鼠的心肌病理學(xué)檢查
　　取出各組40g/L多聚甲醛固定的心肌組織，進行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染

13、色。在光鏡下觀察各組心肌細胞的炎性浸潤和心肌壞死情況，每張心肌組織切片隨機選取5個高倍視野。
　　4、免疫組化檢測各組大鼠RyR2表達情況
　　取出各組40 g/L多聚甲醛固定的心肌組織，進行石蠟包埋、切片、組化前準備、血清封閉、加一抗RyR2(1∶100)、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、封片劑封片，光鏡下觀察各組心肌細胞。用醫(yī)學(xué)分析軟件Image Pro Plus6.0測量照片面積和累積光密度(IOD)并計算，用SPS

14、S軟件分析數(shù)據(jù)。
　　5、Realtime-PCR檢測各組大鼠心肌RyR2mRNA表達水平
　　取出-80℃冷凍保存的心肌組織，在EP管中加入50mg組織與1mlTrizol剪碎心肌組織提取細胞沉淀中的總RNA，所得總RNA通過瓊脂糖凝膠電泳來檢測RNA的完整性和純度，紫外分光光度計測定總RNA的濃度及純度，構(gòu)建大鼠RyR2mRNA引物及熒光探針，進行PCR擴增，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴增前新鮮稀釋陽性模板，取不同梯度上機，繪

15、制熒光定量RT-PCR檢測標準曲線。根據(jù)標準曲線，熒光定量PCR儀自動分析并計算結(jié)果，得出每微克總RNA中待測mRNA的拷貝數(shù)。
　　6、統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用SSPS12.0軟件進行分析，計量資料以(x)±s表示，同組不同時間點采用單因素方差分析，兩組比較采在方差齊情況下用T檢驗（若方差不齊用K個樣本獨立檢驗）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果:
　　1、膿毒性休克大鼠模型建立
　　膿毒性休克

16、組大鼠在給予LPS后血壓會出現(xiàn)暫時下降，穩(wěn)定之后會有所上升，在給藥后2小時左右，平均動脈壓比基礎(chǔ)值下降25％-30％，為膿毒性休克，此時可觀察到大鼠四肢末梢發(fā)紺的現(xiàn)象。生理記錄儀觀察MAP血壓變化，對照組與膿毒性休克組相應(yīng)時間點比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，對照組各時間點與0h的基礎(chǔ)值比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。膿毒性休克組大鼠各時間點MAP與休克0h比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，可以說明此方法制作膿毒性休克模型，給

17、藥2小時左右成模并具有穩(wěn)定性，
　　2、各組大鼠心功能改變結(jié)果
　　2.1.左室舒張末壓變化
　　動態(tài)檢測大鼠左心功能，可發(fā)現(xiàn)膿毒性休克大鼠心功能障礙逐漸加重。休克組大鼠左室舒張末壓(LVEDP)隨休克時間的延長有上升趨勢。對照組大鼠LVEDP隨插管時間變化波動不大。休克組各時間點與對照組對應(yīng)各時間點比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。休克組各時間點與休克0h組LVEDP比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。對照組各時

18、間點與0h組LVEDP比較不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.2.左心室內(nèi)壓改變速率變化
　　觀察大鼠收縮期左心室收縮內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dt max)和舒張期左心室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dt max)。發(fā)現(xiàn)休克大鼠+dp/dt max和-dp/dt max隨休克時間延長明顯下降，同組不同時間點與基礎(chǔ)值比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。對照組大鼠+dp/dt max和-dp/dt max隨插管時間變化

19、波動不大，同組不同時間點與基礎(chǔ)值比較均不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。休克組+dp/dt max和-dp/dt max各時間點與對照組對應(yīng)各時間點比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。
　　3、大鼠心功能改變時心臟組織病理學(xué)變化
　　在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織的心肌結(jié)構(gòu)以及心肌細胞形態(tài)。對照組、休克0h組心肌結(jié)構(gòu)基本正常，細胞形態(tài)也未見明顯異常。休克2h、4h、6h隨著休克時間延長，心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，休克6H可明

20、顯觀察到肌間組織斷裂，心肌細胞崩解，細胞核溶解。
　　4、大鼠心肌組織中RyR2免疫組織化學(xué)定位、總量表達水平及磷酸化變化及隨心功能變化的改變
　　免疫組化結(jié)果顯示，大鼠心肌組織RyR2主要定位于心肌細胞細胞質(zhì)。對照組染色較少，膿毒性休克各個時間點心肌組織內(nèi)RyR2的相對蛋白表達水平除6h組明顯高于對照組相對應(yīng)的各個時間點（P均＜0.01）。膿毒癥休克后隨LPS給藥時間延長RyR2的蛋白表達水平逐漸下降趨勢(P＜0.01)。

21、對照組各時間點與基礎(chǔ)值比較化蛋白表達水平略微上升(P＜0.05)。RYR2磷酸化水平隨休克時間延長逐漸上升(P均＜0.01）。對照組各時間點與基礎(chǔ)值比較化蛋白表達未見明顯改變(P＞0.05)。
　　5、大鼠心肌組織中RyR2 mRNA表達隨心功能變化的改變
　　與膿毒癥時RyR2水平變化趨勢不同，膿毒癥休克0h、2h、4h RYR2 mRNA的相對表達水平明顯高于休克6h組(P＜0.01)。RyR2 mRNA的相對表達量在大

22、鼠休克0h達到高峰，隨著休克時間的延長RyR2 mRNA的表達水平逐漸下降。對照組各時間點與基礎(chǔ)值比較mRNA表達水平略微上升但并未見明顯差異(P＞0.05)。膿毒癥休克各時間點（除6h組）mRNA表達水平顯著高于對照組相對應(yīng)的各個時間點（P均＜0.01），6h組mRNA表達水平休克組與對照組未見明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、本研究通過靜脈注射LPS的方法成功建立膿毒性休克大鼠模型，且隨著給藥時間延長，心肌