YopJ的絲氨酸和賴氨酸雙乙酰化活性及功能.pdf

1、本研究通過模擬耶氏鼠疫桿菌感染過程揭示細(xì)菌性乙酰轉(zhuǎn)移酶YopJ對絲氨酸乙?；c賴氨酸乙?；募?xì)胞學(xué)效應(yīng)。應(yīng)用鳥槍蛋白組學(xué)方法和label-free定量技術(shù)，我們比較了YopJ對細(xì)胞蛋白上的絲氨酸與賴氨酸殘基乙?；挠绊憽Ｌ貏e是我們鑒定出了膜相關(guān)泛素連接酶MARCH8上的絲氨酸與賴氨酸乙?；稽c并制備了針對MARCH8絲氨酸乙?；稽c的抗體，用免疫學(xué)方法證實了YopJ對March8絲氨酸和賴氨酸乙?；挠绊憽opJ催化區(qū)突變體的研究表明

2、YopJ誘導(dǎo)的絲氨酸和賴氨酸乙?；谴呋瘏^(qū)依賴的，催化區(qū)突變體不能有效誘導(dǎo)絲氨酸和賴氨酸乙?；?。我們的結(jié)果表明絲氨酸乙?；竃opJ可以靶向其蛋白底物雙乙?；嚢彼岷徒z氨酸殘基。
　　研究目的:
　　證實YopJ對絲氨酸和賴氨酸殘基雙乙酰化活性與功能
　　研究方法:
　　1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與在HeLa中的表達(dá):YopJ cDNA是全基因合成的，MARCH8 cDNA是通過RT-PCR方法從K562細(xì)胞中擴(kuò)增出來的

3、。MARCH8截斷體是1-156aa，全長是1-291aa。cDNAs被亞克隆到pcDNA3.0-flag載體中，它們的序列都經(jīng)過測序驗證。YopJ催化區(qū)突變體C172A是通過定點突變從YopJ重組質(zhì)粒中擴(kuò)增而來并經(jīng)過測序驗證。重組質(zhì)粒經(jīng)過Omega大抽質(zhì)粒盒子純化后用Lipofectamine轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24-48h后收集細(xì)胞提取蛋白。
　　2、蛋白提取:收集細(xì)胞用PBS洗三遍后，用Millipore RIPA裂解

4、液裂解，通過超聲或冰上裂解法獲取蛋白。
　　3、溶液內(nèi)酶解:在一個過濾膜(Microcon YM-30)上，加入50μg的蛋白樣品，200μ l含8M尿素的1M Tris-HCl中，離心，用50 mM的碳酸氫銨洗兩次，用含1μg胰酶的50 mM碳酸氫銨重懸，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，37℃酶解24h，用C18Ziptip脫鹽后，凍干貯存于-80℃?zhèn)溆谩?br>　　4、免疫沉淀和膠內(nèi)酶解:轉(zhuǎn)染MARCH8和（或）YopJ的HeLa細(xì)胞，常規(guī)方法

5、制得細(xì)胞抽提物，用Flag抗體免疫沉淀帶Flag標(biāo)簽的MARCH8，用SDS-PAGE膠分離，手術(shù)刀片切下MARCH8條帶，標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行膠內(nèi)酶解24h，過zip-tip脫鹽后，LC-MS/MS分析。
　　5、LC-MS/MS分析:取約2μg的肽段注射到C18柱中（200xφ0.075mm），用120 min的線性梯度（5-35％乙腈，0.1％的甲酸水）洗脫，然后用Orbitrap Elite質(zhì)譜儀檢測。數(shù)據(jù)的采集采用數(shù)據(jù)依賴模式，

6、所有掃描的一級質(zhì)譜中前20個最強(qiáng)的峰進(jìn)行二級質(zhì)譜測定。MS/MS二級質(zhì)譜用Mascot和Sequest搜索人蛋白數(shù)據(jù)庫(UniProtKB，88295 entries)，分析軟件是Proteome Discoverer1.4(Thermo Scientific，San Jose，CA).MS/MS質(zhì)譜圖搜庫的容差是0.8 Da，10 ppm，動態(tài)修飾是賴氨酸、絲氨酸乙?；?，甲硫氨酸氧化。所有修飾位點的確認(rèn)需要經(jīng)過人工檢索圖譜確定。

7、>　　6、Label-free定量:Label-free方法測量肽段的豐度是由Progenesis LC-MSsoftware(version4.1; Nonlinear Dynamics，UK)完成的。簡言之，質(zhì)譜獲得的Raw文件用ReAdw-program程序轉(zhuǎn)換成mzxml格式，并輸入到ProgenesisLC-MS軟件中。多個分析并行時，離子強(qiáng)度圖可用來診斷檢測的缺陷。最好的數(shù)據(jù)集被選作數(shù)據(jù)校準(zhǔn)的參照。排除電荷數(shù)為1或＞4的肽段

8、。同時搜一個反庫(decoy database)來確定出錯率(FDR)。每個通過質(zhì)譜確定的有效肽段的定量定義為該位點的所有肽段豐度之和。統(tǒng)計學(xué)分析根據(jù)某一位點所有乙酰化肽段豐度之和與未修飾肽段之和的比值。溶液內(nèi)酶解的數(shù)據(jù)，有時找不到對應(yīng)的非乙酰化肽段，就采用某一位點所有乙?；亩呜S度之和與一套α-actin的參考肽段豐度之和的比值.
　　7、MARCH8 Sac71多克隆抗體的制備:化學(xué)合成March8乙?；亩蜸ac71，Ac-

9、T(Sac) ITPSSQDICRICHCEGDC-NH2及相應(yīng)的未修飾肽段 S71，Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH2，并經(jīng)質(zhì)譜驗證純度在90％以上。乙酰化肽段與BSA偶聯(lián)后，免疫新西蘭大白兔三次，末次免疫10天后采血用ELISA法測抗體滴度，末次注射15天后采取所有的血樣收集抗血清?？寡暹^兩次與未修飾肽段偶聯(lián)的色譜柱去除與未修飾肽段結(jié)合部分，再過一次與修飾肽段偶聯(lián)的色譜柱,收集與修飾肽段結(jié)合的成分?？贵w的特異性

10、經(jīng)過Dot-blot和競爭實驗驗證。
　　8、免疫沉淀-WB:帶Flag標(biāo)簽的MARCH8用Flag抗體進(jìn)行免疫沉淀，沉淀得到的蛋白用SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5％ BSA封閉。一抗用anti-flag、泛賴氨酸乙?；贵w、MARCH8 Sac71抗體檢測。二抗是熒光標(biāo)記的IRDye800CW或IRDye680CW conjugated IgG，結(jié)果用LI-COR遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)掃描。
　　9、體外乙酰

11、化實驗（用YopJ重組細(xì)胞抽提物）:轉(zhuǎn)染有MARCH8的HeLa細(xì)胞抽提物用Flag抗體進(jìn)行IP，將MARCH8固定在瓊脂糖珠子上，進(jìn)行體外乙?；磻?yīng)。第一份與空載對照pcDNA3.0-flag的細(xì)胞抽提物孵育，第二份與轉(zhuǎn)染YopJ的HeLa細(xì)胞抽提物孵育，第三份與轉(zhuǎn)染YopJ突變體C172A的HeLa細(xì)胞抽提物孵育。所有體系中都添加乙酰輔酶A，蛋白酶抑制劑，去乙?；敢种苿?，在37℃孵育1h，孵育結(jié)束后，洗滌，用western-blo

12、t分析結(jié)果。一抗為anti-flag、泛賴氨酸乙?；贵w(Pan-K)、MARCH8 Sac71抗體。
　　研究結(jié)果:
　　1、乙酰轉(zhuǎn)移酶YopJ介導(dǎo)了HeLa細(xì)胞蛋白絲氨酸和賴氨酸殘基的雙乙?；?用鳥槍蛋白組學(xué)和Label-free定量，我們證明YopJ的轉(zhuǎn)染可以引起細(xì)胞蛋白絲氨酸和賴氨酸乙?；奶岣撸渲邪?0個絲氨酸乙?；稽c(YopJ/non-YopJ1.3-fold，p=0.02)和8個賴氨酸乙?；稽c(YopJ

13、/non-YopJ3.5-fold，p=0.00003)。
　　2、絲氨酸乙?；竃opJ可以雙乙?；疎3泛素連接酶MARCH8的絲氨酸和賴氨酸殘基:用免疫沉淀和LC-MS/MS證明，YopJ的轉(zhuǎn)染可以雙乙酰化MARCH8的S44，S71，S253位點以及K247，K252位點。label-free定量表明YopJ轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中Sac253和Sac44分別提高了28±11(p=0.002)和31±8(p=0.002)倍，Ka

14、c252和Kac247分別提高了36±18(p=0.0003)和18±8(p=0.01)倍。
　　3、體內(nèi)外免疫實驗均證明乙酰化酶YopJ可以雙乙?；疢ARCH8的絲氨酸和賴氨酸殘基:為證實YopJ對MARCH8的雙乙?；饔?，我們制備了MARCH8 Sac71特異性抗體，Dot-blot和競爭實驗均證明該抗體是針對Sac71的特異性抗體。IP-WB證實YopJ與MARCH8共轉(zhuǎn)HeLa細(xì)胞之后，MARCH8的絲氨酸和賴氨酸乙?；?/p>

15、水平都得到明顯提高，絲氨酸乙?；岣吡?.8倍(1.8±0.5，p=0.027，n=3)，賴氨酸乙?；岣吡?.9倍(1.9±0.4，p=0.012，n=3)，證明MARCH8中可以在體內(nèi)提高絲氨酸和賴氨酸乙?；?。與此一致的是，共轉(zhuǎn)YopJ的催化區(qū)突變體C172A與MARCH8，MARCH8的絲氨酸和賴氨酸乙酰化水平并未得到相應(yīng)的提高，說明YopJ的雙乙酰化作用是催化區(qū)依賴的。為進(jìn)一步證明YopJ是直接乙酰化了MARCH8的賴氨酸和

16、絲氨酸殘基，我們又進(jìn)行了體外試驗，首先我們用免疫沉淀得到的MARCH8與轉(zhuǎn)染YopJ的HeLa細(xì)胞抽提物及乙酰輔酶A于37℃共同孵育1h，然后用MARCH8 Sac71和Pan-K乙酰化抗體分別檢測MARCH8的絲氨酸和賴氨酸乙?；?，結(jié)果與空載對照相比，YopJ可以明顯提高M(jìn)ARCH8的絲氨酸和賴氨酸乙酰化水平而其突變體C172A的這種能力明顯降低。為進(jìn)一步排除YopJ細(xì)胞抽提物中其他因素的干擾，我們又用純化的YopJ進(jìn)行了體外乙酰

17、化實驗，結(jié)果與用YopJ細(xì)胞抽提物得到的結(jié)果相似，充分證明了YopJ對MARCH8絲氨酸和賴氨酸殘基的雙乙?；饔?。
　　4、YopJ對MARCH8的雙乙?；岣吡薓ARCH8的自身泛素化水平且這種作用是催化區(qū)依賴的:為探討YopJ對MARCH8的雙乙?；募?xì)胞學(xué)或生物學(xué)功能，我們檢測了MARCH8的自身泛素化水平。結(jié)果表明，與YopJ共轉(zhuǎn)的MARCH8的體外自身泛素化水平比單轉(zhuǎn)MARCH8的明顯提高，YopJ突變體C172A提高

18、MARCH8自身泛素化水平的能力明顯降低，說明這一能力是催化區(qū)依賴的。
　　研究結(jié)論:
　　我們通過鳥槍蛋白組學(xué)和Label-free方法證明了絲氨酸乙?；竃opJ對細(xì)胞蛋白水平和靶蛋白MARCH8絲氨酸和賴氨酸殘基的雙乙?；?，并用免疫學(xué)方法用體內(nèi)外實驗證明了YopJ對MARCH8的雙乙?；崾窘z氨酸乙?；唾嚢彼嵋阴；g可能構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)。特別是，YopJ的雙乙?；瘏⑴c了MARCH8的自身泛素化過程，提示了MARCH8雙乙