4-1BB信號在Treg中的免疫調(diào)控作用及同種異源Treg對腫瘤細胞直接效應(yīng)初步研究.pdf

1、第一部分多發(fā)性骨髓瘤患者Treg表達水平及4-1BB信號在Treg中的免疫調(diào)控作用
　　目的：
　?。?）研究多發(fā)性骨髓瘤患者Treg的表達水平
　?。?）探討4-1BB信號對Treg細胞的促增殖作用。
　　方法：
　?。?）采用免疫熒光和流式細胞術(shù)檢測多發(fā)性骨髓瘤患者外周血和骨髓Treg表達；
　?。?）采用免疫磁珠法分選CD4+CD25+CD127low/-細胞，利用流式細胞術(shù)測定其表面4-1BB

2、表達，同時加入IL-2后測定其4-1BB表達有無改變；
　?。?）采用免疫磁珠法富集骨髓瘤原代細胞，與同源PBMC進行腫瘤淋巴細胞混合培養(yǎng)，CFSE法測定阻斷4-1BB/4-1BBL信號通路后CD4+CD25high細胞的增殖改變
　　結(jié)果：
　　（1）多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Treg水平較正常對照組高，多發(fā)性骨髓瘤患者的Treg水平與臨床特征和預(yù)后無明顯相關(guān)性；
　?。?）Treg細胞表面構(gòu)成性表達4-1BB分子

3、，IL-2可上調(diào)Treg表面4-1BB表達，
　　（3）原代骨髓瘤細胞表面高表達4-1BBL分子，通過4-1BB-FC交聯(lián)4-1BBL阻斷4-1BB活化信號能夠抑制Treg增殖.
　　結(jié)論：多發(fā)性骨髓瘤患者Treg細胞表達水平上調(diào)，Treg細胞表面構(gòu)成性表達4-1BB分子，其介導(dǎo)的4-1BB正向信號可促進Treg細胞增殖，提示4-1BB信號可能為調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的干預(yù)靶點。
　　第二部分同種異源Treg對腫瘤細胞直接效應(yīng)

4、的初步研究
　　目的：探討抗原特異性的Treg細胞對腫瘤細胞的直接效應(yīng)
　　方法：
　?。?）分離正常供體單核細胞，以粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和重組白細胞介素(IL-4）誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得不成熟樹突狀細胞；
　?。?）以負載腫瘤抗原的樹突狀細胞誘導(dǎo)抗原特異性 Treg體外生成和擴增
　　（3）把抗原特異性Treg與骨髓瘤細胞系進行體外共培養(yǎng)，采用Annexin-V/PI染色法測定骨髓瘤細胞凋亡

5、水平有無改變，采用CFSE測定骨髓瘤細胞增殖是否受抑，采用細胞內(nèi)因子染色法測定骨髓瘤細胞合成IL-6水平有無改變，
　?。?）測定活化后CD95L在Treg表面有無上調(diào).
　　結(jié)果：
　?。?）通過形態(tài)和表型特征鑒定證實培養(yǎng)所得不成熟樹突狀細胞；
　?。?）采用樹突狀細胞能夠誘導(dǎo)Treg體外擴增，7天后擴增效率達10倍
　?。?）擴增所得抗原特異性Treg能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖，細胞內(nèi)因子染色提示