4-1BBL-4-1BB共刺激信號(hào)對(duì)過(guò)敏性支氣管哮喘中Th17-Treg細(xì)胞平衡的調(diào)控研究.pdf

1、目的：
　　 本研究欲探討4-1BBL在過(guò)敏性支氣管哮喘的表達(dá)特征及其在過(guò)敏性哮喘發(fā)病中的作用，4-1BB抗體干預(yù)對(duì)Th17/Treg細(xì)胞功能失衡的調(diào)節(jié)。進(jìn)一步明確哮喘的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制以及4-1BBL/4-1BB共刺激分子在哮喘中的作用機(jī)制，為尋求哮喘的免疫學(xué)治療提供新思路。
　　 方法：
　　 （一）人體研究
　　 我們使用ELISA方法檢測(cè)了過(guò)敏性哮喘患者和健康對(duì)照組血漿中可溶性4-1BBL（solu

2、ble 4-1BBL：s4-1BBL）的濃度，流式細(xì)胞術(shù)分析了過(guò)敏性哮喘患者和健康對(duì)照組單核細(xì)胞膜表面表達(dá)4-1BBL（m4-1BBL）的比例；利用real-time PCR技術(shù)相對(duì)定量的分析了哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells：PBMC）4-1BBL mRNA的表達(dá)情況。分離過(guò)敏性哮喘患者PBMC，體外加激動(dòng)性4-1BB單抗或不加激動(dòng)性4-1BB單抗，特異性刺激72小時(shí)收集細(xì)

3、胞和上清液，ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-17A、TGF-β的濃度，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)刺激后Th17、Treg（regulatory T cells：Treg）細(xì)胞的比例。
　　 （二）動(dòng)物模型研究
　　 SPF級(jí)BALB/c小鼠隨機(jī)分為哮喘組、4-1BB干預(yù)組和陰性對(duì)照組，每組6-10只，哮喘組小鼠于D0、D7、D14腹腔注射卵清蛋白（OVA）與佐劑氫氧化鋁(AL(OH)3)致敏，于D27、D28、D29 OVA滴鼻

4、激發(fā)構(gòu)建哮喘模型，4-1BB干預(yù)組于D0天致敏后立即腹腔注射激動(dòng)性4-1BB單抗，其余處理同哮喘組，陰性對(duì)照組所有處理由PBS代替。所有動(dòng)物在第30天處死，眼球取血ELISA法檢測(cè)血清IgE，HE染色觀察各組呼吸道炎性反應(yīng)，支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid：BALF）細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類計(jì)數(shù)，ELISA檢測(cè)BALF中細(xì)胞因子IL-17A、TGF-β，蛋白免疫印跡法（western blotting）比

5、較哮喘組與陰性對(duì)照組4-1BBL的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)分析肺組織Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例，real-time PCR相對(duì)定量小鼠肺組織炎癥部位RORγt mRNA與Foxp3 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．哮喘患者外周血s4-1BBL與單核細(xì)胞表達(dá)4-1BBL較對(duì)照組均顯著下降，但PBMC中4-1BBL mRNA的表達(dá)無(wú)明顯下降；同時(shí)哮喘小鼠肺組織炎癥部位的4-1BBL蛋白明顯下降。
　　 2．哮喘

6、患者PBMC體外刺激72小時(shí)后，4-1BB抗體干預(yù)組較同型對(duì)照組，細(xì)胞上清液中IL-17濃度下降而TGF-β濃度升高，但兩組Th17、Treg細(xì)胞數(shù)無(wú)差異性。
　　 3．建立哮喘小鼠模型，哮喘組小鼠可見(jiàn)支氣管肺泡周圍有大量的炎癥浸潤(rùn)，血清IgE濃度升高，BALF中細(xì)胞總數(shù)與嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)顯著增加，而激動(dòng)型4-1BB抗體干預(yù)組與哮喘組比較，小鼠支氣管肺泡炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，血清IgE濃度下降，且BALF中細(xì)胞總數(shù)與嗜酸性粒細(xì)胞均

7、顯著減小。
　　 4．哮喘組小鼠BALF中細(xì)胞因子IL-17濃度升高，TGF-β濃度降低；哮喘組小鼠肺組織炎癥部位Th17細(xì)胞數(shù)及其特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達(dá)顯著增加，而Treg細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)差異性，但Foxp3 mRNA顯著下降。
　　 5．4-1BB激動(dòng)型抗體體內(nèi)干預(yù)小鼠能抑制哮喘小鼠BALF中IL-17濃度的升高而促進(jìn)TGF-β的分泌，且能抑制哮喘小鼠肺組織炎癥部位Th17細(xì)胞與RORγt mRN

8、A的表達(dá)；其雖不能增加哮喘小鼠肺組織中Treg細(xì)胞的數(shù)量，但能促進(jìn)Treg細(xì)胞發(fā)揮功能所依賴的細(xì)胞因子Foxp3 mRNA的表達(dá)增加。
　　 結(jié)論：
　　 1．哮喘患者外周血以及哮喘小鼠肺組織的氣道炎癥部位4-1BBL的表達(dá)減少，這說(shuō)明4-1BBL/4-1BB提供的共刺激信號(hào)的減少參與了哮喘的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。
　　 2．哮喘小鼠的氣道炎癥部位存在Th17/Treg細(xì)胞功能的失衡，這種失衡可能與4-1BBL/4-1