早期冠心病miRNA標(biāo)志物熒光診斷技術(shù)與系統(tǒng)研究.pdf

1、熒光檢測在醫(yī)學(xué)檢驗、食品衛(wèi)生、動植物檢驗檢疫上應(yīng)用廣泛。利用熒光檢測方法對核酸進(jìn)行定量分析和特異性識別在生物醫(yī)學(xué)上具有重要的意義。核酸中的MicroRNA(miRNA)與生命體發(fā)展過程中多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在調(diào)控時間順序上，miRNA對基因表達(dá)的調(diào)控先于蛋白變化，因此，可作為潛在的疾病早期診斷標(biāo)志物。但是，傳統(tǒng)的miRNA檢測方法大多操作步驟繁瑣，檢測時間長，需要使用價格昂貴的檢測儀器，操作人員需要專門培訓(xùn)，檢測成本高。難以滿

2、足快速、即時檢測低豐度miRNA的要求。本研究利用miRNA可對某些疾病提前表達(dá)的特性，基于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)檢測miRNA技術(shù)，通過對特異性miRNA進(jìn)行標(biāo)記，利用光電檢測方法，根據(jù)標(biāo)志物受激發(fā)出的熒光強(qiáng)度分析得出miRNA的初始濃度。為特異性miRNA快速、即時檢測提供一種新技術(shù)，利用此技術(shù)開發(fā)的miRNA熒光檢測系統(tǒng)可為冠心病等慢性疾病提供進(jìn)行風(fēng)險分層和早期預(yù)警的儀器。研究圍繞熒光快速檢測，具體做了以下幾方面的工作:
　　從

3、熒光產(chǎn)生的機(jī)理出發(fā)，通過理論分析，計算出采用共焦式熒光檢測系統(tǒng)和非共焦式熒光檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生的熒光光子數(shù)。分析出若采用共焦結(jié)構(gòu)，激發(fā)光光功率1.2mW，則要求光電探測器最低探測靈敏度不低于2.77×10-7W;若采用非共焦結(jié)構(gòu)，在相同光照強(qiáng)度下，要求光電探測器最低探測靈敏度不低于1.98×10-7W。依據(jù)理論計算結(jié)果選擇非共焦結(jié)構(gòu)中的正入射結(jié)構(gòu)為本研究miRNA熒光檢測系統(tǒng)的光學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　根據(jù)miRNA熒光檢測特點(diǎn)，系統(tǒng)設(shè)計

4、上選擇采用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù)對冠心病特異性miRNA進(jìn)行擴(kuò)增，采用SYBR GreenⅡ熒光染料作為熒光標(biāo)記物，依據(jù)熒光染料參數(shù)選擇相應(yīng)的光源為發(fā)光二極管(LED)，探測器為光電倍增管(PMT)。根據(jù)滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)方式和熒光檢測結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過理論計算，選擇使用半導(dǎo)體加熱作為miRNA熒光檢測系統(tǒng)的加熱方式。通過對激發(fā)光光束進(jìn)行光學(xué)整形設(shè)計，使其滿足系統(tǒng)的應(yīng)用要求。對樣品池進(jìn)行設(shè)計，使其既利于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng)，又方便熒光信號

5、探測，且隔絕了不同樣品之間熒光信號的串?dāng)_。最后，通過軟件設(shè)計，完成數(shù)據(jù)處理及人機(jī)交互。
　　通過設(shè)計相應(yīng)的驗證實(shí)驗，獲得miRNA熒光檢測系統(tǒng)的多項技術(shù)指標(biāo)。得出miRNA熒光檢測系統(tǒng)熒光強(qiáng)度線性偏倚不超過±5％、重復(fù)性不低于95％、系統(tǒng)最低檢出限為12個拷貝等指標(biāo)。使用miRNA熒光檢測系統(tǒng)，對從心肌細(xì)胞中提取的冠心病標(biāo)志物miR-499進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。從檢測結(jié)果可以看出，miRNA熒光檢測系統(tǒng)可以滿足冠心病特異性miR

6、NA實(shí)時檢測的目的。實(shí)驗得出通過合理設(shè)置滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)條件，冠心病特異性miRNA檢測所需時間低于30分鐘。
　　通過驗證實(shí)驗得出miRNA熒光檢測系統(tǒng)檢測靈敏度與實(shí)時熒光定量PCR儀靈敏度相近，但miRNA熒光檢測系統(tǒng)檢測miRNA所需時間遠(yuǎn)低于實(shí)時熒光定量PCR儀檢測miRNA所需時間。這為特異性miRNA快速、即時檢測提供了一種有價值的檢測技術(shù)。miRNA熒光檢測系統(tǒng)采用正交式檢測結(jié)構(gòu)，通過整體設(shè)計，降低系統(tǒng)背景光噪聲，提高熒