DNA損傷修復基因Xrcc1和代表性納米材料對雄性生殖系統(tǒng)的影響及機制研究.pdf

1、不孕不育一直是生殖健康研究領(lǐng)域一個亟待解決的重大科學問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織預測，在21世紀，不孕不育將成為僅次于腫瘤和心腦血管病的第三大疾病。研究表明，半個多世紀以來，人類精液質(zhì)量顯著下降，精子生成障礙已成為男性不育最常見的病因，也是我國成年男性生殖健康面臨的最主要威脅。
　　精子生成障礙可能與遺傳因子改變，環(huán)境化學污染物暴露等密切相關(guān)。精子發(fā)生是一個連續(xù)的細胞分裂分化過程，包括精原細胞分裂增殖、精母細胞減數(shù)分裂和精子細胞變態(tài)三個主

2、要階段，最終形成成熟的精子。在這個復雜的過程中，生物體與生俱來的DNA損傷修復機制能夠及時修復來源于外界環(huán)境或生物體自身產(chǎn)生的損傷。本實驗室前期通過原發(fā)性無精子癥病例對照研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷修復基因X射線修復交叉互補蛋白1(X-Ray Repair Cross Complementing1，XRCC1)單核苷酸多態(tài)性是原發(fā)性無精子癥的遺傳易感因素，但無法解釋精子生成障礙的分子機制。本研究首先構(gòu)建了Xrcc1基因敲除小鼠模型研究其在精子發(fā)

3、生中的作用;由于人類遺傳物質(zhì)相對穩(wěn)定，短時間內(nèi)的人類的遺傳變異是有限的，因此精子生成障礙也有可能受到環(huán)境因素的影響，環(huán)境因素種類眾多，進而我們選擇在生殖系統(tǒng)中缺乏安全性評價的納米材料作為研究對象，來評價納米材料對雄性生殖的影響。
　　我們的研究假設(shè)是:1.DNA損傷修復基因Xrcc1在小鼠精子發(fā)生中有著至關(guān)重要的作用;2.代表性納米材料可能對生殖細胞DNA造成損傷，進而影響精子發(fā)生過程。為驗證上述假設(shè):1.基于Xrcc1全敲除小鼠

4、胚胎致死的報道，我們采用Cre-Loxp條件性基因敲除策略構(gòu)建原始生殖細胞特異的Xrcc1基因敲除小鼠模型，綜合評價該模型中小鼠精子發(fā)生過程及其狀態(tài);2.通過小鼠精原干細胞體外培養(yǎng)，探討Xrcc1在其正常生理功能的作用;3.通過納米材料的體外生殖細胞系的評價，探討環(huán)境因素在精子生成障礙中的作用。
　　第一部分DNA損傷修復基因Xrcc1在雄性小鼠生殖功能中的作用及機制研究
　　目的：
　　XRCC1能夠作為DNA損傷修

5、復過程中的招募蛋白，與DNA損傷修復過程中的修復蛋白相互作用，發(fā)揮DNA損傷修復能力。以往研究表明DNA損傷修復過程在生殖細胞中的意義重大。然而，Xrcc1在維持精子發(fā)生以及生殖系統(tǒng)中的確切功能尚不清楚。
　　方法：
　　我們通過Cre-Loxp原理構(gòu)建原始生殖細胞條件性基因敲除Xrcc1的小鼠模型，結(jié)合生殖功能評價實驗、病理學檢測、以及分子機制研究，綜合闡明Xrcc1在小鼠精子發(fā)生過程中的作用。
　　結(jié)果：
　

6、　通過交配生育實驗發(fā)現(xiàn)Xrcc1完全敲除的小鼠出現(xiàn)不育的表型。與對照組相比，Xrcc1敲除組小鼠的精子數(shù)目和精子活力均顯著降低。睪丸組織病理結(jié)果提示Xrcc1敲除組曲細精管有明顯的病理改變。Xrcc1敲除組小鼠精原細胞發(fā)現(xiàn)凋亡的發(fā)生、睪丸組織氧化應(yīng)激的增加和線粒體功能紊亂。此外，Xrcc1敲除組小鼠的精原細胞干性因子受到損傷。
　　結(jié)論：
　　缺失Xrcc1后，小鼠的精原細胞干性發(fā)生紊亂，小鼠睪丸的線粒體功能受損以及出現(xiàn)凋亡

7、現(xiàn)象。Xrcc1參與小鼠精子發(fā)生的正常生理過程。
　　第二部分DNA損傷修復基因Xrcc1在小鼠精原干細胞中的作用及機制研究
　　目的：
　　為進一步明確小鼠原始生殖細胞中Xrcc1的缺失，線粒體功能異常、及細胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)系，采用體外精原干細胞(Spermatogonia Stem Cells，SSCs)模型來驗證這一假設(shè)。
　　方法：
　　通過建立SSCs模型，同時構(gòu)建Xrcc1干擾RNA包裝的腺

8、病毒，通過腺病毒敲減SSCs中的Xrcc1，同時處理抗氧劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)來評價SSCs中的氧化應(yīng)激狀態(tài)及線粒體功能指標。
　　結(jié)果：
　　Xrcc1缺乏可以引起SSCs的自我更新和自我分化因子減少，氧化應(yīng)激相關(guān)指標增加，造成線粒體基因組上編碼呼吸鏈復合物的轉(zhuǎn)錄本減少、細胞ATP水平降低，并且降低精子發(fā)生相關(guān)基因的表達。NAC的補充可以緩解因Xrcc1的減少而引起的氧化應(yīng)激和

9、線粒體基因組上編碼呼吸鏈復合物的轉(zhuǎn)錄本減少和細胞ATP水平的降低，但對自我更新和自我分化因子和精子發(fā)生相關(guān)基因表達沒有作用。
　　結(jié)論：
　　在SSCs中，Xrcc1的減少可以通過氧化應(yīng)激來影響細胞線粒體功能，以及通過其他途徑來影響SSCs的干性維持和精子發(fā)生。
　　第三部分代表性納米材料暴露對小鼠精母細胞DNA的影響第一節(jié)多壁碳納米管對小鼠精母細胞的影響
　　目的：
　　多壁碳納米管在許多領(lǐng)域廣泛使用，已

10、有研究報道其高劑量可以造成雄性小鼠生殖系統(tǒng)可逆性損傷。然而，低劑量多壁碳納米管的生殖效應(yīng)數(shù)據(jù)有限。
　　方法：
　　運用鼠源性精母細胞系模型(GC-2spd)評價多壁碳納米管的生殖毒性效應(yīng)。采用細胞活力實驗選擇不影響細胞活力的劑量，透射電子顯微鏡觀察多壁碳納米管在細胞中的蓄積情況，PCR方法檢測多壁碳納米管對生殖細胞DNA的影響。
　　結(jié)果：
　　發(fā)現(xiàn)0.5μg/mL的多壁碳納米管在精母細胞系中不引起細胞活力降低

11、。在這個劑量下，細胞周期和細胞活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)水平均沒有影響。但是，與對照相比，該劑量下多壁碳納米管能夠蓄積在線粒體，引起精母細胞線粒體DNA的損傷，線粒體氧耗率和細胞ATP水平也有不同程度下降。
　　結(jié)論：
　　0.5μg/mL多壁碳納米管可以特異性的導致生殖細胞線粒體DNA損傷具潛在生殖毒性。
　　第二節(jié)納米氧化鋅對小鼠支持細胞和精母細胞DNA的影響
　　目的：

12、
　　納米氧化鋅作為近年來在生活領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的納米材料，雖然大多數(shù)研究者聚焦于納米氧化鋅的人體健康效應(yīng)，然而涉及雄性生殖系統(tǒng)的數(shù)據(jù)非常有限。
　　方法：
　　以鼠源性支持細胞(TM-4)和精母細胞(GC-2spd)作為體外模型，研究亞致死劑量納米氧化鋅的生殖效應(yīng)及其分子機制。運用分子生物學方法闡明納米氧化鋅對支持細胞功能和精母細胞DNA的影響。
　　結(jié)果：
　　兩個細胞模型中8μg/mL納米氧化鋅是亞致死劑

13、量，ROS均增加。支持細胞的納米氧化鋅處理組，谷胱甘肽水平下降，丙二醛水平上升，支持細胞中血睪屏障相關(guān)蛋白(ZO-1，occludin，claudin-5和connexin-43)均下調(diào);納米氧化鋅處理后出現(xiàn)細胞膜通透性增加和腫瘤壞死因子α分泌增多。精母細胞中出現(xiàn)細胞S期阻滯和DNA損傷，抗氧化劑NAC處理可部分挽救這一表型。
　　結(jié)論：
　　納米氧化鋅暴露可引起細胞ROS產(chǎn)生、生殖細胞DNA損傷，以及下調(diào)支持細胞的血睪屏障