采用AT方案新輔助化療的Luminal A型乳腺癌患者血漿外泌體microRNA特征研究.pdf

1、外泌體(exosome)為細(xì)胞膜或多囊泡胞內(nèi)體與細(xì)胞膜融合過程中所產(chǎn)生的分子直徑30～100nm的小囊泡，在真核生物的血液、尿液和唾液等多種甚至全部體液中廣泛分布。近年來針對(duì)外泌體及其所含microRNA(miRNA)的研究發(fā)現(xiàn)，其與乳腺癌的發(fā)病及預(yù)后關(guān)系密切，并且可能在乳腺癌的早期診斷和臨床評(píng)估中發(fā)揮重要作用。截至目前，已有大量針對(duì)乳腺癌細(xì)胞外泌體miRNA的研究發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)展階段和耐藥性息息相關(guān)。遺憾的是，大多數(shù)研究都在

2、細(xì)胞系中進(jìn)行，其miRNA的變化并不能完全代表患者體內(nèi)miRNA水平的波動(dòng)。此外由于外泌體的研究是近年來新興的熱點(diǎn)，受制于樣本數(shù)量及實(shí)驗(yàn)規(guī)模，目前多數(shù)的研究仍基于既往血漿或病理組織中的結(jié)果展開。因此在本研究中，將直接針對(duì)乳腺癌患者血漿外泌體的研究，采用二代測(cè)序的方法對(duì)外泌體miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全面、深入的分析，篩選其可能的核心靶點(diǎn)，并嘗試建立與療效、預(yù)后等臨床事件的關(guān)聯(lián)。
　　目的：1)探索不同方法提取外泌體miRNA的差異，

3、構(gòu)建有臨床應(yīng)用價(jià)值的實(shí)驗(yàn)方法;
　　2)明確外泌體miRNA在新輔助化療效果差異的Luminal A型乳腺癌患者中的不同表達(dá)水平以及用藥前后的波動(dòng)，分析其可能作用的靶基因及其功能
　　3)利用生物信息學(xué)分析乳腺癌患者血漿外泌體mirna的總譜，進(jìn)一步明確其調(diào)控的靶基因的功能聚類，并基于大數(shù)據(jù)驗(yàn)證差異表達(dá)的靶基因。
　　方法：1)用超速離心法或試劑盒沉降法提取晚期乳腺癌患者血漿中的外泌體;通過透射電鏡鑒定外泌體及West

4、ern Blot法驗(yàn)證外泌體標(biāo)志蛋白，明確外泌體在乳腺癌患者血漿中的分布;
　　2)用試劑盒提取外泌體總RNA，針對(duì)miRNA構(gòu)建文庫，進(jìn)行二代測(cè)序;比較療效不同的接受紫杉醇聯(lián)合表柔比星化療的晚期LuminaA型乳腺癌患者血漿外泌體中miRNA分布水平的差異;
　　3)結(jié)合DIANA Tools、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫分析血漿外泌體miRNA的靶基因及下游信號(hào)通路。
　　結(jié)果：1)由試劑盒沉降外泌體并繼而使用試劑盒提取

5、總RNA較傳統(tǒng)的超速離心分離外泌體以及Trizol提取RNA，可獲得相對(duì)更高的得率，在血樣保存時(shí)間較長，總量較少的情況下仍能獲得較滿意外泌體RNA提取結(jié)果;
　　2)通過文庫構(gòu)建及二代測(cè)序獲得的所有樣本的小RNA片段與miRBase數(shù)據(jù)庫對(duì)比，共鑒定出1446種已知miRNA，表達(dá)量最高的miRNA中，部分如miR16、miR22已被證實(shí)在乳腺癌患者的血漿和組織中高表達(dá);
　　3)利用edgeR分析PR及SD病人樣本間miR

6、NA的差異表達(dá)，篩選出9個(gè)在SD組中表達(dá)顯著上調(diào)的miRNA，13個(gè)明顯表達(dá)下調(diào)，miR454在Kaplan Meire plot數(shù)據(jù)庫中與總生存期相關(guān)（p小于0.05）;而針對(duì)5位PR病人化療前及化療中miRNA的測(cè)定發(fā)現(xiàn)共6個(gè)miRNA呈下降趨勢(shì)，99個(gè)miRNA呈上升趨勢(shì)
　　4)基于生物信息學(xué)分析對(duì)差異表達(dá)的miRNA靶基因進(jìn)行GO聚類分析，顯示這些其功能涉及RNA合成、代謝及轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞遷移等相關(guān)的生物過程。KE

7、GG通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因主要參與了藥物代謝、GnRH、Hedgehog等信號(hào)通路;
　　5)利用String平臺(tái)進(jìn)行的靶基因蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并通過Cytospace軟件對(duì)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選出在療效相關(guān)的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中作為重要節(jié)點(diǎn)的CALM2、CREB1等基因以及化療前后差異變化的miRNA所調(diào)控的節(jié)點(diǎn)基因KRAS、PTEN等;
　　6)參考TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者轉(zhuǎn)錄組與RN

8、A測(cè)序的信息，進(jìn)一步篩選與差異表達(dá)的miRNA與相關(guān)性高的靶基因，其功能聚類提示仍以大分子代謝、發(fā)育及形態(tài)發(fā)生為主，而互作網(wǎng)絡(luò)分析則篩選出PPP2CA、IGF1等節(jié)點(diǎn)基因;
　　7)探索差異表達(dá)的miRNA及節(jié)點(diǎn)基因TCGA數(shù)據(jù)庫中LuminalA型乳腺癌樣本的表達(dá)水平，miR184、miR144及KITLG在不同分期病人中的表達(dá)水平具有差異性。
　　結(jié)論：1)試劑盒沉降外泌體并繼而使用試劑盒提取總RNA，在血樣保存時(shí)間較長

9、，總量較少的情況下仍能獲得相對(duì)較高的得率;
　　2)二代測(cè)序篩選出22個(gè)在PR及SD的病人樣本間差異表達(dá)的miRNA，其中2個(gè)在Kaplan Meire blot數(shù)據(jù)庫中與總生存期相關(guān)，2個(gè)在TCGA中得到驗(yàn)證;針對(duì)5位PR病人化療前及化療中差異表達(dá)的miRNA共發(fā)現(xiàn)2個(gè)miRNA呈下降趨勢(shì)，60個(gè)miRNA呈上升趨勢(shì);
　　3)差異表達(dá)的miRNA其靶基因主要與參與大分子合成代謝、細(xì)胞發(fā)育相關(guān)，并參與藥物代謝、GnRH等信