ROS敏感納米粒靶向釋放SDF-1α趨化BMSCs歸巢治療電燒傷血管損傷.pdf

1、研究背景:
　　電燒傷是現(xiàn)代工業(yè)社會(huì)特有的意外傷害，雖然發(fā)病率不高，但因其損傷是立體的，并具有夾心樣壞死和漸進(jìn)性壞死的特點(diǎn)，造成局部組織損害嚴(yán)重，住院患者的截肢率超過(guò)30％，肢體往往遺留不同程度功能障礙，臨床危害性大。血管損傷所致的組織缺血缺氧性壞死是電燒傷組織漸進(jìn)性壞死的重要原因。目前臨床上并無(wú)針對(duì)性的減輕血管損傷、促進(jìn)血管修復(fù)的治療。如何促進(jìn)電燒傷局部血管快速修復(fù)，對(duì)減輕組織壞死、改善預(yù)后具有重要意義。
　　骨髓間充質(zhì)干

2、細(xì)胞(BMSCs)具有向多種細(xì)胞分化的潛能。在燒創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下，BMSCs能從骨髓中迅速動(dòng)員進(jìn)入外周循環(huán)，在損傷局部歸巢并分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞，進(jìn)一步分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞或直接分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與血管損傷的修復(fù)。BMSCs的動(dòng)員、趨化、聚集主要依賴于基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)的趨化作用，而這種趨化作用依賴于局部高濃度的SDF-1α以及循環(huán)中的SDF-1α濃度梯度。因此，局部形成高濃度的SDF-1α以及循環(huán)中的SDF-1α濃度梯度是

3、趨化并捕捉干細(xì)胞參與血管修復(fù)的必要條件。
　　然而，如何在損傷局部形成高濃度的SDF-1α以及循環(huán)中的SDF-1α濃度梯度是一個(gè)難題。直接血管內(nèi)注射SDF-1α?xí)杆俦谎合♂屵M(jìn)入全身循環(huán)而不能在損傷局部形成持久的有效濃度;直接組織內(nèi)注射SDF-1α分布不均勻，易降解，且進(jìn)入循環(huán)的效率不確定。隨著藥物載體材料技術(shù)的發(fā)展，將SDF-1α通過(guò)可生物降解的納米粒系統(tǒng)給藥，不僅能有效防止其在體內(nèi)快速降解，還可以將SDF-1α靶向輸送至體內(nèi)

4、有效部位，達(dá)到定向緩釋的目的。
　　實(shí)現(xiàn)納米粒藥物的靶向釋放，關(guān)鍵是確定病變部位特殊的物理、化學(xué)或生物學(xué)特性?；钚匝?ROS)作為生物體內(nèi)病理性存在的致病因子，為納米粒藥物的靶向釋放提供了靶點(diǎn)。在我們的前期研究中，利用對(duì)ROS敏感的硫醇縮酮聚合物PPADT為納米粒載體，將SDF-1α蛋白包載其中，研制出了SDF-1α-PPADT納米粒，該納米?？梢虿∽兘M織內(nèi)高氧自由基濃度發(fā)生裂解而釋放藥物，從而達(dá)到靶向治療目的。本研究中，我們通過(guò)

5、制備大鼠電燒傷血管損傷模型，尾靜脈注射SDF-1α-PPADT納米粒，評(píng)價(jià)其通過(guò)靶向釋放SDF-1α、定向趨化BMSCs歸巢對(duì)電燒傷血管損傷修復(fù)的作用。
　　研究方法:
　　1、電燒傷血管損傷模型的制備
　　自制電燒傷設(shè)備，220V的電壓持續(xù)電擊大鼠6s。
　　2、電燒傷血管損傷的鑒定
　　傷后沿近心端方向切取電擊部位含主干血管肌肉的組織，假電燒傷組同樣部位取材，HE染色和CD31免疫組化染色觀察血管損傷情

6、況。
　　3、損傷局部組織ROS檢測(cè)
　　ROS熒光染色和ROS的RealTime PCR測(cè)定，觀察傷后局部ROS水平變化。
　　4、損傷局部組織SDF-1α含量測(cè)定
　　調(diào)節(jié)電擊時(shí)間的長(zhǎng)短造成不同程度的組織損傷，ELISA測(cè)定局部SDF-1α水平變化。
　　5、SDF-1α-PPADT納米粒的制備
　　根據(jù)前期研究結(jié)果制備納米粒，先合成對(duì)ROS敏感的納米材料PPADT分子片段，然后通過(guò)復(fù)乳溶媒萃取法

7、制備包含SDF-1α蛋白的載藥納米粒。
　　6、ROS敏感的SDF-1α靶向釋放效應(yīng)的驗(yàn)證
　　傷后輸注SDF-1α-PPADT納米粒，分別從SDF-1α的在體分布和局部SDF-1α蛋白水平變化觀察納米粒體內(nèi)靶向釋放SDF-1α的情況。
　　7、BMSCs的定向趨化和歸巢效應(yīng)驗(yàn)證
　　傷后輸注SDF-1α-PPADT納米粒，同時(shí)輸注外源性的綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記的GFP-BMSCs，免疫熒光染色觀察GFP的分布，

8、驗(yàn)證納米粒對(duì)BMSCs的定向趨化歸巢效應(yīng)。
　　8、SDF-1α-PPADT納米粒對(duì)血管修復(fù)的作用
　　傷后輸注SDF-1α-PPADT納米粒，HE染色和CD31免疫組化染色觀察血管損傷修復(fù)情況。
　　研究結(jié)果:
　　1、電燒傷局部的大體觀察
　　電燒傷后所有大鼠均存活良好，電極板處形成Ⅲ度燒傷創(chuàng)面，大鼠電擊后表現(xiàn)為雙后肢跛行。
　　2、電燒傷可致血管損傷
　　電燒傷大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞呈釘突樣凸向

9、管腔，連續(xù)性中斷，內(nèi)膜剝脫，管腔縮窄。
　　3、損傷局部ROS含量顯著升高
　　電燒傷大鼠血管損傷局部ROS綠色熒光分布明顯，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的mRNA表達(dá)水平增高。
　　4、一定范圍內(nèi)局部電燒傷程度與SDF-1α水平成反比
　　輕度電燒傷組織局部SDF-1α產(chǎn)生增多，但是隨著電燒傷損傷程度的加重，組織局部SDF-1α產(chǎn)生下降，電擊6s時(shí)損傷局部組織SDF-1α持續(xù)處于低水平狀態(tài)。
　　

10、5、SDF-1α-PPADT納米粒具有良好的靶向藥物釋放效應(yīng)
　　輸注納米粒后，Cy5熒光顯示SDF-1α僅靶向分布于血管損傷局部，且損傷局部SDF-1α水平顯著提高。
　　6、SDF-1α-PPADT納米粒定向趨化BMSCs歸巢
　　輸注納米粒后第7天，可觀察到GFP-BMSCs陽(yáng)性細(xì)胞在血管損傷局部明顯聚集。
　　7、SDF-1α-PPADT納米粒促進(jìn)血管損傷修復(fù)
　　輸注納米粒后第10天，電燒傷大鼠血