飼養(yǎng)猴群中諾如病毒感染的初步探討.pdf

1、人諾如病毒（Human Norovirus，簡稱huNoVs）是導(dǎo)致人類非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病因，近年來其感染導(dǎo)致的發(fā)病率和致死率都在不斷升高。所有年齡人群對(duì)該病毒感染均敏感。雖然多數(shù)人感染諾如病毒后可自愈，但對(duì)兒童和免疫缺陷人群仍構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。諾如病毒分子進(jìn)化快、人群感染后持續(xù)排毒、低劑量感染及傳播途徑多樣性等特點(diǎn)使得諾如病毒暴發(fā)流行較為嚴(yán)重，因此感染后快速確診和及時(shí)治療很重要。研發(fā)有效的疫苗不僅可以減輕公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，還可以提

2、高國民經(jīng)濟(jì)效益和生活質(zhì)量。然而，目前諾如病毒體外培養(yǎng)體系和體內(nèi)動(dòng)物模型的缺乏，給疫苗研發(fā)造成極大的阻礙。
　　本研究主要目的是通過對(duì)飼養(yǎng)猴群中諾如病毒感染情況的初步探索，為以后建立諾如病毒的非人類靈長類動(dòng)物感染模型打下基礎(chǔ)。為此，本論文主要進(jìn)行了以下6個(gè)部分的研究：1）通過TaqMan熒光定量RT-PCR方法對(duì)某人工飼養(yǎng)猴群及某醫(yī)院患者糞便中的諾如病毒排毒情況進(jìn)行檢測，檢測猴群中諾如病毒排毒情況是為后期動(dòng)物模型構(gòu)建篩選合適動(dòng)物和病

3、毒株，檢測人群中諾如病毒流行情況為后期人諾如病毒感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)篩選病毒株;2）選取部分陽性樣品進(jìn)行全基因組序列擴(kuò)增，通過全基因比對(duì)可以了解諾如病毒的進(jìn)化與變異;3）通過PCR擴(kuò)增得到一株猴源GⅡ.17型諾如病毒的P結(jié)構(gòu)域及P結(jié)構(gòu)域變體基因，進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，在原核表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白，純化后的蛋白免疫小鼠后制備抗血清，并通過Western Blot和ELISA分析蛋白的抗原性，為后期諾如病毒感染動(dòng)物后樣品檢測做準(zhǔn)備;4）用含有G

4、Ⅱ.17型諾如病毒的糞便濾液在自然狀態(tài)下通過口服感染健康猴子，分析感染后猴子的臨床癥狀和排毒情況，為諾如病毒感染動(dòng)物模型的構(gòu)建做初步探索;5）通過ELISA方法對(duì)獼猴來源的唾液樣本進(jìn)行分型后，用前面表達(dá)純化得到的P結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白進(jìn)行唾液結(jié)合實(shí)驗(yàn)，有助于諾如病毒感染機(jī)制的研究;6)分離并初步進(jìn)行獼猴腸上皮細(xì)胞的3D培養(yǎng)，為后期諾如病毒常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及疫苗中和評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。
　　通過以上研究，我們得到如下結(jié)果：
　　(1

5、)共檢測獼猴糞便樣品28例，人源糞便樣品49例，諾如病毒在獼猴和患者中陽性檢出率分別為28.57％、36.73％，確定了諾如病毒可以感染獼猴。
　　(2)通過RT-PCR擴(kuò)增得到一株GⅡ.17型猴源諾如病毒全基因組序列，Genebank號(hào)為：KX356908。此外，還擴(kuò)增獲得了三株GⅡ.4型人源諾如病毒全基因組序列。
　　(3)測序結(jié)果表明，我們成功地構(gòu)建了P結(jié)構(gòu)域及其變體基因原核表達(dá)質(zhì)粒。SDS-PAGE分析顯示，誘導(dǎo)表達(dá)

6、P結(jié)構(gòu)域蛋白在超聲裂解上清和包涵體中都有，而其變體蛋白主要存在于超聲裂解上清中。Western Blot和ELISA結(jié)果表明，表達(dá)純化得到的P結(jié)構(gòu)域及其變體蛋白有很好的抗原性和免疫原性。表達(dá)的蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)的抗體ELISA效價(jià)達(dá)到1∶32000。
　　(4)攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，獼猴口服含諾如病毒的糞便濾液后，雖然沒有出現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐、腹瀉等臨床癥狀（這與健康成年人感染諾如病毒臨床表現(xiàn)相一致），但是具有較為明顯的糞便排毒。而且進(jìn)一步的

7、ELISA分析血清中諾如病毒抗體滴度結(jié)果表明，盡管攻毒前2只獼猴血清中均有較高諾如病毒特異性抗體滴度，然而隨著感染后時(shí)間的推移，ELISA效價(jià)有所增加。
　　(5)唾液表型分析發(fā)現(xiàn)，獼猴群中唾液表型A、B、AB、H分布比率分別為15.79％、68.42％、14.04％、1.75％。通過正交實(shí)驗(yàn)檢測獼猴血液樣本的ABO分型，發(fā)現(xiàn)唾液表型與血液表型相符。當(dāng)用諾如病毒P結(jié)構(gòu)域蛋白P-RGD或P結(jié)構(gòu)域變體蛋白PΔR與唾液樣本結(jié)合時(shí)并未發(fā)現(xiàn)

8、明顯結(jié)合，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討和驗(yàn)證結(jié)果。
　　(6)為得到腸道干細(xì)胞來源的腸細(xì)胞，我們首先通過EDTA螯合法成功分離到獼猴結(jié)腸來源腸上皮隱窩，然后通過基質(zhì)膠模擬3D環(huán)境培養(yǎng)腸隱窩，在生長因子的誘導(dǎo)下可見其生長，然而腸細(xì)胞的組織形態(tài)及生長規(guī)律等特征還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。
　　結(jié)論：本論文通過分析某飼養(yǎng)猴群和某醫(yī)院諾如病毒的感染情況發(fā)現(xiàn)，其陽性檢出率分別為28.57％和37.63％。諾如病毒全基因組序列分析表明猴群中的GⅡ.17型諾