荒漠地區(qū)優(yōu)勢(shì)地衣石果衣Endocarponpusillum Hedwing全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與初步分析.pdf

1、地衣作為一種特殊的菌藻共生復(fù)合生物或共生聯(lián)合體，也被視為有控制地寄生于藻類(lèi)或藍(lán)細(xì)菌上的真菌，即地衣型真菌，它能適應(yīng)低溫、干旱等惡劣的生存環(huán)境。從嚴(yán)寒的南北兩極到酷熱的赤道，從高山到平原，從潮濕的土壤到干旱的沙漠，在其它植物不能生長(zhǎng)的地方，常?？梢哉业降匾隆１狙芯棵嫦蚋珊瞪衬卫淼膰?guó)家需求，圍繞干旱沙漠生物地毯工程的基礎(chǔ)研究，從地衣中篩選抗旱基因以創(chuàng)造抗旱轉(zhuǎn)基因植物提供基因資源和技術(shù)儲(chǔ)備，以沙坡頭地區(qū)地衣優(yōu)勢(shì)種石果衣（Endocarpon

2、 pusillum Hedwing）中分離的共生菌為材料，從中進(jìn)行抗旱基因篩選及其功能分析，主要進(jìn)行了以下的研究：
　　 （1）率先構(gòu)建了國(guó)內(nèi)外第一個(gè)地衣型真菌的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，其文庫(kù)的滴度為1.5×106cfu/mL，重組率為95.5％。根據(jù)文庫(kù)小規(guī)模測(cè)序結(jié)果，篩選出111個(gè)全長(zhǎng)基因序列。這些序列在地衣型真菌中為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道，BLAST結(jié)果顯示42個(gè)CDS序列與非地衣型真菌有關(guān)基因的同源性大于75％；30個(gè)CDS序列與非地

3、衣型真菌基因的同源性為60％-74％；28個(gè)CDS序列與非地衣型真菌基因的同源性小于60％，而11個(gè)CDS序列未發(fā)現(xiàn)與非地衣型真菌有同源性。由此可以推測(cè)，這些基因可能為地衣型真菌所特有，與地衣型真菌與藻類(lèi)共生相關(guān)，或者在干旱荒漠地衣生命活動(dòng)中起重要作用。
　　 （2）利用絕對(duì)定量PCR方法計(jì)算石果衣共生菌基因組的大小。從文庫(kù)中挑選15個(gè)基因進(jìn)行測(cè)定，選擇其中10個(gè)擴(kuò)增效率接近理論值的基因結(jié)果作為計(jì)算數(shù)據(jù)，最后得出共生菌的基因組大

4、小的平均值為39.13Mb。
　　 （3）利用相對(duì)定量PCR方法計(jì)算rRNA基因重復(fù)單位的數(shù)目。選擇3個(gè)基因（SCD，ATA，RPB11a）作為相對(duì)定量的參照基因。通過(guò)BLAST比對(duì)得知這三個(gè)基因在非地衣型真菌中為單拷貝基因。最后，計(jì)算出重復(fù)單位數(shù)目的平均值為43。
　　 （4）構(gòu)建含有原肌球蛋白（Tropomyosin-1）編碼全長(zhǎng)cDNA的重組載體，然后轉(zhuǎn)化入E.Coli BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的重組蛋白經(jīng)