凍融法制備水溶性殼聚糖中低溫脫乙酰與高溫?zé)岱纸獾臋C理及動力學(xué).pdf

1、殼聚糖作為自然界唯一的堿性多糖，因其良好的生物相容性、廣譜抗菌性、生物可降解性、重金屬螯合性、成膜成纖性等特殊功能，引起了廣泛關(guān)注。由于其只能溶于某些特殊酸性溶液，部分結(jié)構(gòu)和功能實際由殼聚糖鹽體現(xiàn)，這對殼聚糖的理論和應(yīng)用研究的深入十分不利。制備較高分子質(zhì)量、非衍生化的、真正意義上的水溶性殼聚糖(Water-Soluble Chitosan，WSC)，對相關(guān)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究意義重大。
　　 本研究采用堿液凍融循環(huán)處理甲殼素，并結(jié)

2、合均相脫乙酰反應(yīng)，不引入任何基團，制備了1種脫乙酰度(Degree of Deacetylation，DDA)約50％，分子量約30萬，pH12以下冷水可溶的WSC，突破了傳統(tǒng)制備方法耗時長、收率低、成本高、降解嚴(yán)重、水溶性差的缺陷。通過低溫脫乙酰動力學(xué)研究、采用XRD、FT-IR、Raman、DSC、CD和AFM等考察凍融對甲殼素結(jié)構(gòu)的影響，從而發(fā)展凍融循環(huán)處理為1種簡便、可控、綠色、高效的甲殼素前處理手段，并初步揭示了WSC的形成機

3、理。為合理利用WSC，本研究考察了其熱穩(wěn)定性和安全性，并采用多重掃描速率熱分析法、FT-IR及MTT實驗等，揭示了WSC的熱分解機理、熱分解動力學(xué)及細(xì)胞毒性等。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．慢速冷凍過程中冰晶的形成和生長可破壞甲殼素分子間氫鍵作用，降低分子結(jié)構(gòu)規(guī)整性，破壞凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)并使其結(jié)晶度下降。但單純冷凍導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)破壞和結(jié)晶度降低的程度較小，不足以使甲殼素形成完全均相溶液，且這種結(jié)晶破壞作用部分可逆，經(jīng)加熱處理后又會形成新的

4、結(jié)晶結(jié)構(gòu)。慢速冷凍——低溫解凍的凍融循環(huán)處理過程中冰晶的反復(fù)形成和重結(jié)晶能夠更徹底的破壞甲殼素凝聚態(tài)特別是晶態(tài)結(jié)構(gòu)，-18℃下凍融3次，可使甲殼素在NaOH溶液中完全溶解，獲得甲殼素終濃度約為4wt%，NaOH終濃度約為10.67wt%的均相溶液，25℃經(jīng)過48h-72h靜置，可制備幾乎全溶的WSC。
　　 2．低溫脫乙酰動力學(xué)研究結(jié)果表明，堿液濃度、反應(yīng)時間、解凍方式及其交互作用均顯著影響脫乙酰進程。乙酰氨基含量與反應(yīng)時間在半

5、對數(shù)坐標(biāo)軸上線性相關(guān)(R2＞0.9000)，低溫非均相下脫乙酰反應(yīng)符合準(zhǔn)一級反應(yīng)動力學(xué)方程，表觀速率常數(shù)3.3-22.8×10-3h-1；35wt%NaOH，-5℃--35℃下的表觀反應(yīng)活化能為9.76kJ/mol，低于常溫及高溫反應(yīng)活化能，表明冷凍特別是凍融循環(huán)可促進反應(yīng)進行。
　　 3．XRD結(jié)果表明，凍融循環(huán)處理能顯著降低甲殼素分子內(nèi)和分子間強氫鍵相互作用，破壞甲殼素分子致密的晶體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其水溶成為可能。FT-IR分析結(jié)

6、果表明，水溶性樣品或近似水溶的樣品，3448cm-1處-OH的振動吸收峰明顯移向低波數(shù)區(qū)域，且水溶性越好偏移量越大，該區(qū)域面積越小；代表分子內(nèi)/分子間氫鍵相互作用的3265和3103cm-1處的吸收峰，在水溶性樣品上已經(jīng)觀測不到。DSC研究結(jié)果表明，DSC的峰面積、峰高等參數(shù)不但與DDA有關(guān)，更受水溶性即結(jié)晶性的影響，甚至某些時候結(jié)晶度的影響要遠(yuǎn)超DDA的影響。CD研究結(jié)果也表明，凍融循環(huán)和均相脫乙酰打破了分子間強氫鍵相互作用，使WSC

7、的空間結(jié)構(gòu)更為舒展，較少呈現(xiàn)螺旋結(jié)構(gòu)，更易溶于水中。AFM結(jié)果表明，WSC在水溶液中以中性，而不是以質(zhì)子化形式存在，說明本研究制備的是1種自然狀態(tài)下的殼聚糖而非其衍生物。
　　 4．DDA-定時，WSC水溶液在208nm-212nm的吸光度A與波長λ呈線性關(guān)系，其斜率與對應(yīng)溶液的濃度呈線性關(guān)系，初步建立了1種用紫外多波長回歸測定WSC水溶性的新方法，從而克服了傳統(tǒng)的濾紙稱重法繁瑣、準(zhǔn)確度不高的缺點。
　　 5．熱分解產(chǎn)物

8、FT-IR結(jié)果研究表明，殼聚糖、甲殼素和WSC的熱降解是高分子主鏈的無規(guī)解聚，降解最先發(fā)生在鍵能較弱的C-O-C上，其中WSC的熱分解起始位壘更高，分解過程中伴隨更多復(fù)雜反應(yīng)。殼聚糖鹽酸鹽(Chitosan Hydrochloride，CHC)的熱分解是典型的多步反應(yīng)，先是高分子銨鹽的分解，后為高分子主鏈的解聚。
　　 6．多重掃描速率法研究了殼聚糖、甲殼素、WSC和CHC的熱分解反應(yīng)動力學(xué)，4種物質(zhì)的反應(yīng)活化能E和指前因子In

9、A值分別為153.02±2.67、162.96±5.47、188.20±1.98、169.40±1.52(1st stage)、126.5±1.62 kJ/mol(2nd stage)和23.46±1.47、23.09±1.14、37.82±1.12、35.28±0.62(1st stage)、24.69±0.44 min-1(2nd stage)。 Achar法判定了4種物質(zhì)熱分解的最概然機理函數(shù)。殼聚糖為f(a）=3/2（1-α)2

10、/3[1-（1-α)1/3]-1，屬三維擴散、球形對稱機理：甲殼素為f(α）=3/2(1-α)4/3[1/(1-α)1/3-1]-1，屬三維擴散機理；WSC為f(α)=2(1-α)3/2，屬2/3級化學(xué)反應(yīng)；CHC2個分解階段最概然機理函數(shù)相同，均為f(α)=1-α，屬每個顆粒上只有1個核心的隨機成核和隨后生長機理。
　　 7．WSC細(xì)胞毒性研究結(jié)果顯示，WSC無細(xì)胞毒性，未質(zhì)子化的氨基對L929細(xì)胞具有一定保護作用。動態(tài)凝血實