大黃及其活性物質(zhì)灌腸對慢性腎臟病模型大鼠作用的分子機制.pdf

1、目的:
　　慢性腎臟病(CKD)已成為全球重大的公共衛(wèi)生健康問題之一。目前對于慢性腎臟病發(fā)病及進(jìn)展的病因病理機制尚未完全清楚。目前臨床主要以對癥治療及透析替代治療為主，且治療時間長，為社會、家庭以及患者自身帶來了沉重的健康以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，如何延緩CKD進(jìn)展具有非常重要的社會、經(jīng)濟(jì)意義。當(dāng)今國際腎臟病學(xué)界一直致力于探索CKD進(jìn)展的機制和有效延緩CKD進(jìn)展的新治療方法，且中醫(yī)藥已經(jīng)成為國外預(yù)防治療相關(guān)疾病的主要的補充替代治療方法之

2、一。在我國近50年來，以大黃為主的中藥灌腸治療已作為中醫(yī)藥特色療法被廣泛運用于臨床腎臟病治療，其能有效改善慢性腎臟病便秘等腸道功能障礙，且能清除尿毒素等，具有延緩慢性腎臟病進(jìn)展的作用，但目前對其機制尚不清楚，國內(nèi)外相關(guān)研究較少。目前國內(nèi)外越來越多研究顯示腸道微生態(tài)尤其是腸道菌群與CKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，提出了腸腎軸理論模型，已成為腎病領(lǐng)域的研究熱點。因此，本課題試圖基于腸腎軸理論模型，從以腸道菌群為中心的腸道微生態(tài)的角度去探討大黃及其

3、活性物質(zhì)大黃素延緩慢性腎臟病進(jìn)展的分子機制，為進(jìn)一步推廣中醫(yī)藥特色療法灌腸以及探討中醫(yī)藥結(jié)腸靶向延緩CKD的防治新策略奠定理論及應(yīng)用基礎(chǔ)。
　　方法:
　　本實驗研究分為大黃灌腸及活性物質(zhì)大黃素灌腸對CKD模型大鼠的作用及其相關(guān)機制研究兩部分。均采用5/6腎切除模型為CKD模型，大鼠8周成模后隨機均分為對照治療組和實驗治療組，假手術(shù)模型為空白對照組。1）在大黃灌腸實驗中，選擇大黃顆粒劑作為大黃實驗用藥，采用超高效液質(zhì)聯(lián)用及超

4、高效液相色譜法進(jìn)行大黃顆粒劑指紋圖譜檢測及大黃素含量定量分析;以無菌水灌腸CKD模型大鼠為對照治療組（5ml/天），大黃灌腸為實驗組，每天給予0.1g/ml大黃顆粒劑溶液（5ml/天，相當(dāng)于0.3g/m1的生大黃）保留灌腸2min;連續(xù)灌腸4周后，收集血液、尿液、腎臟、結(jié)腸以及糞便組織，分別檢測生化指標(biāo)（包括全血分析、血肌酐、尿液肌酐比、肌酐清除率以及超敏C-反應(yīng)蛋白hs-CRP），腎臟病理HE、Masson染色以及腎臟組織纖維化定量，

5、免疫熒光法檢測腎臟組織8-OHdG、NF-κB蛋白，Western-blot法進(jìn)一步檢測腎臟組織NF-κ B蛋白含量，結(jié)腸組織HE染色，新鮮糞便主要進(jìn)行六種腸道細(xì)菌培養(yǎng)（包括腸桿菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌、真菌、乳桿菌、雙歧桿菌），免疫組化法檢測結(jié)腸固有蛋白claudin-1、occludin的表達(dá)、液質(zhì)聯(lián)用法檢測血清硫酸吲哚酚(IS)水平、鱟試劑法檢測血清內(nèi)毒素脂多糖(LPS)水平，從而評價大黃灌腸對慢性腎臟病模型大鼠腎臟及腸道微生態(tài)

6、的影響。2）在大黃素灌腸實驗中，以0.4％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液灌腸(5ml/天)慢性腎臟病模型大鼠為對照治療組，大黃素灌腸組為實驗組，每天給予5ml(0.215mg/ml大黃素)大黃素保留灌腸2min，連續(xù)灌腸4周后，收集血液、尿液以及糞便組織，分別檢測生化指標(biāo)（包括血肌酐、尿素氮、全血分析、尿蛋白肌酐比以及肌酐清除率），實時熒光定量PCR法檢測糞便16S rNDA中主要腸道細(xì)菌數(shù)量（包括腸桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌、脆弱擬桿

7、菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌），液質(zhì)聯(lián)用法檢測血清硫酸吲哚酚，鱟試劑法檢測血清內(nèi)毒素脂多糖以及采用二代高通量測序檢測糞便腸道菌群16S rNDA，使用Mothur1.29平臺和QIIME平臺進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析腸道菌群二代測序結(jié)果。實驗獲得的計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，使用GraphPad Prism5.0分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布多組之間比較采用單因素ANOVA分析和Student-Newman-Kueuls Q檢驗進(jìn)行兩兩組間比較

8、分析，不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗，兩兩組間比較采用Cruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05表示統(tǒng)計學(xué)有顯著差異。
　　結(jié)果:
　　1)大黃灌腸對慢性腎臟病模型大鼠作用及機制的實驗結(jié)果顯示:大黃素單體在大黃顆粒劑中的含量比例為0.215％。與假手術(shù)對照組相比，無菌水灌腸組和大黃灌腸組CKD大鼠的血肌酐、尿蛋白肌酐比、LPS水平顯著增加(P＜0.05)，而兩組肌酐清除率明顯降低（P＜0.05）。與假手術(shù)組比，無菌水

9、灌腸組對照組IS和hs-CRP水平均顯著增加（P＜0.05）。與無菌水灌腸組相比，大黃灌腸組則顯著降低血肌酐、IS、hs-CRP以及LPS水平（P＜0.05），明顯提高肌酐清除率（P＜0.05）。HE染色顯示在無菌水對照治療組中，慢性腎臟病大鼠腎臟組織出現(xiàn)明顯的管狀腔增大、蛋白管型、管狀萎縮和伴隨許多單核細(xì)胞浸潤和間質(zhì)纖維化的間質(zhì)擴張，結(jié)腸組織出現(xiàn)黏膜層水腫且固有層炎癥浸潤嚴(yán)重，而進(jìn)行大黃灌腸治療后則減弱了這些組織病理學(xué)變化。腎臟Mas

10、son染色顯示無菌水對照治療組中慢性腎臟病大鼠出現(xiàn)顯著的腎小管間質(zhì)纖維化，而經(jīng)過大黃灌腸治療4周后，腎小管間質(zhì)性纖維化的進(jìn)展明顯延遲且腎小管間質(zhì)性纖維化評分明顯降低了約18.75％（P＜0.05)。無菌水對照組CKD大鼠腎臟組織在腎小球和腎小管中都顯示出明顯增加的8-OHdG陽性區(qū)域，且NF-κB的表達(dá)在腎小球和腎小管中顯著增加且western-blot定量其表達(dá)明顯增加（P＜0.05)，而大黃灌腸治療后不能減弱腎小球中的8-OHdG表

11、達(dá)，但可以減弱其在腎小管中的表達(dá)，且減少了殘余腎臟中NF-κB的表達(dá)特別是在小管中表達(dá)，且western-blot法定量顯示其表達(dá)明顯減少（P＜0.05)。腸道主要細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示三組之間的Enteroroccus（腸球菌）、Staphylococcus aureus（金黃色葡萄球菌）和Fungi（真菌）數(shù)量沒有顯著差異。與假手術(shù)組相比，無菌水灌腸對照組中的E.coli（腸桿菌）明顯增加（P＜0.05)，大黃灌腸實驗組的E.coli（腸

12、桿菌）、Lactobacillus（乳桿菌）、Bifidbacteria（雙歧桿菌）明顯增加（P＜0.05）;與無菌水灌腸對照組相比，大黃灌腸實驗組的Bifidbacteria（雙歧桿菌）明顯增加（P＜0.05）。與假手術(shù)組相比，無菌水灌腸對照組結(jié)腸上皮claudin-1和occludin蛋白明顯減少，而經(jīng)大黃灌腸干預(yù)后結(jié)腸上皮claudin-1和 occludin蛋白明顯增加。2）大黃素灌腸對慢性腎臟病模型大鼠作用及其機制的實驗結(jié)果顯

13、示:與假手術(shù)對照組相比，0.4％CMC-Na對照灌腸組和大黃素灌腸組的血肌酐、尿素濃度和尿蛋白肌酐比明顯增加(P＜0.05)，而血紅蛋白、血細(xì)胞比容水平、肌酐清除率和體重則明顯降低(P＜0.05)。與假手術(shù)組相比，0.4％CMC-Na灌腸對照組IS和LPS水平顯著增加(P＜0.05)。與CMC-Na灌腸對照組相比，大黃素灌腸組則明顯降低尿素氮濃度、尿蛋白肌酐比、IS以及LPS水平（P＜0.05）。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示三組之間的

14、所有細(xì)菌的總數(shù)沒有顯著變化。與假手術(shù)組相比，CMC-Na灌腸對照組中的Clostridium Perfringens（產(chǎn)氣莢膜梭菌）明顯增加（P＜0.05)，而Lactobacillus（乳桿菌）顯著降低（P＜0.05)。與CMC-Na灌腸對照組相比，大黃素灌腸實驗組的Lactobacillus（乳桿菌）明顯增加（P＜0.05)，E.coli（腸桿菌）、Enteroroccus（腸球菌）和Clostridium Perfringens（

15、產(chǎn)氣莢膜梭菌）顯著減少（P＜0.05)。二代測序結(jié)果共得到128，238個序列，共3，744個OTUs，平均每個樣品為488±120個OTUs，測序樣本稀釋曲線以及α多樣性分析均顯示測序樣品已經(jīng)具有其大部分特征且捕獲了其菌群多樣性，加權(quán)UniFrac PCoA分析顯示三組相互偏離，以表示其各組腸道菌群結(jié)構(gòu)差異大。在門分類上，相比于假手術(shù)組或CMC-Na灌腸對照組，大黃素灌腸實驗組Tenericutes門明顯增加（P＜0.05）。在屬分類

16、上，與假手術(shù)組相比，CMC-Na灌腸對照組中乳桿菌屬明顯減少(P＜0.05)。與CMC-Na灌腸對照組中相比，大黃素灌腸實驗組組的未分類來自S24-7科的屬和梭菌屬明顯減少（P＜0.05），而來自RF39目未分類屬和擬桿菌屬顯著增加(P＜0.05)，乳桿菌略有增加。且發(fā)現(xiàn)梭菌屬與尿素氮和IS明顯正相關(guān)(P＜0.05)，普雷沃氏菌屬、乳桿菌屬與尿素氮顯著負(fù)相關(guān)性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　通過進(jìn)行大黃灌腸對CKD大鼠模

17、型的作用及其機制的研究，我們可知大黃灌腸可以延緩CKD進(jìn)展，其可能的分子機制主要是通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)主要包括調(diào)節(jié)腸道菌群主要增加雙歧桿菌益生菌的數(shù)量、恢復(fù)固有黏膜蛋白claudin-1、occludin以及減少內(nèi)毒素LPS水平，減少CKD狀態(tài)的尿毒素IS生成，從而緩解CKD的系統(tǒng)炎癥，進(jìn)一步改善腎功能、腎臟炎癥氧化應(yīng)激及腎纖維化?？梢姶簏S灌腸具有多靶點多層次作用于CKD大鼠的特點。我們進(jìn)一步進(jìn)行了大黃中有效活性物質(zhì)大黃素單體物質(zhì)對CKD

18、大鼠模型的作用及其分子機制探索。結(jié)果充分表明了大黃素灌腸治療可以減少尿毒癥毒素尿素氮以及腸源性尿毒素IS，減少血清LPS水平，從而減少系統(tǒng)炎癥和腎損害，其可能的重要機制是調(diào)節(jié)腸道微生物群的結(jié)構(gòu)，尤其是減少了有害細(xì)菌(例如梭菌屬Clostridium)，包括產(chǎn)氣莢膜梭菌種C.Perfringens)的數(shù)量，并且增加了腸道中有益細(xì)菌例如乳桿菌屬(Lactobacillus)的數(shù)量，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)致病菌屬梭菌屬與尿素氮和IS尿毒素水平明顯正相關(guān)