發(fā)菜中麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的克隆及其在脅迫條件下的響應(yīng).pdf

1、發(fā)菜是一種極端環(huán)境下生長(zhǎng)的陸生藍(lán)藻,對(duì)逆境具有極強(qiáng)的適應(yīng)力,因此是抗逆性研究中一種典型的植物資源,對(duì)其抗逆性研究具有重要的意義。目前人們對(duì)發(fā)菜適應(yīng)極端環(huán)境的研究已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注,但是還沒(méi)有突破性的進(jìn)展。本研究以發(fā)菜這一具有很強(qiáng)抗逆性的絲狀藍(lán)藻作為研究材料,應(yīng)用基因工程技術(shù),從發(fā)菜中克隆得到合成海藻糖途徑的一個(gè)重要酶:麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTH,轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá),并對(duì)蛋白進(jìn)行了純化和酶活測(cè)定。同時(shí),通過(guò)干旱和鹽脅迫發(fā)菜,

2、檢測(cè)其MTS和MTH酶的表達(dá)量及相同條件下海藻糖和蔗糖的含量情況。得到以下結(jié)果和結(jié)論:
　　 首先通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,從發(fā)菜(Nostoc flaglliforme)中克隆出MTH的基因TreZ,對(duì)該基因序列測(cè)序表明開(kāi)讀框全長(zhǎng)1848 bp,編碼的蛋白質(zhì)有615個(gè)氨基酸。
　　 通過(guò)生物信息學(xué)分析得到該基因編碼的氨基酸序列包含四個(gè)麥芽寡糖基海藻糖水解酶的高度保守區(qū)域。將該基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)到

3、在0.5 mM IPTG誘導(dǎo)條件下該基因在大腸桿菌中有很高的表達(dá)量,分子質(zhì)量約為70 kD。所得的重組蛋白經(jīng)過(guò)純化后,用麥芽六糖作為底物進(jìn)行酶活反應(yīng),能水解麥芽四糖海藻糖為海藻糖。
　　 在干旱和鹽脅迫下,發(fā)菜中的海藻糖和蔗糖的積累量都顯著升高,同時(shí)麥芽糖基海藻糖水解酶和合成酶的表達(dá)量也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。
　　 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功地從發(fā)菜中克隆到預(yù)測(cè)的麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTH的基因TreZ,并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá),