蘋果MdCIPK6的基因克隆及其在逆境脅迫響應(yīng)中的作用.pdf

1、鈣調(diào)磷酸酶B類蛋白（calcineurin B-like proteins，CBLs）是近年來鑒定出的一類植物中特有的Ca2+傳感器，與其互作的蛋白CIPK（CBL-interacting protein kinase）一起在植物特定的生長發(fā)育和應(yīng)答脅迫過程中起重要作用。研究表明，CIPK廣泛參與植物對高鹽、干旱和低溫等非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。目前對于CIPK的研究主要集中在擬南芥，水稻上等少數(shù)模式植物上，對于果樹方面研究甚少。由于多方面

2、的原因，可用來耕種的土地越來越少，同時由于世界范圍內(nèi)氣候的變化，果樹的種植面積和范圍將嚴重的受到影響。挖掘蘋果CIPK基因并進行功能研究，不但具有重要的理論意義，而且具有廣泛的應(yīng)用價值，可以為果樹抗逆轉(zhuǎn)基因育種提供潛在的有效候選基因。本研究從蘋果中克隆到一個CIPK基因MdCIPK6，并對其基因結(jié)構(gòu)特點，表達特異性及其功能等進行了分析。主要研究工作與結(jié)果如下：
　　 1.利用RACE的方法，克隆得到MdCIPK6全長cDNA，總

3、長度為1565bp，其中ORF區(qū)為1299bp，編碼一條含433個氨基酸的多肽，預(yù)測的PI為8.98，分子量為48.50 kDa。蛋白結(jié)構(gòu)上具有CIPK所共有的N端激酶結(jié)構(gòu)域和C端NAF保守結(jié)構(gòu)域。
　　 2.半定量RT-PCR結(jié)果表明，它在各個組織和器官中組成型表達，而在根中的表達量相對較低。但是，用NaCl和ABA處理嘎啦生根組培苗，發(fā)現(xiàn)MdCIPK6明顯在根中受到誘導(dǎo)表達。此外，在非生物逆境脅迫，激素以及外源Ca2+處理下

4、，都能明顯誘導(dǎo)其表達。說明MdCIPK6基因有可能在抗逆脅迫響應(yīng)中有重要作用。
　　 3.酵母雙雜試驗表明，MdCIPK6能夠和擬南芥的AtCBL4（AtSOS3）蛋白相互作用；功能互補試驗結(jié)果表明，MdCIPK6和MdCIPK6T175D能夠部分互補擬南芥sos2突變體抗鹽方面的功能。在野生型中擬南芥過量表達MdCIPK6和MdCIPK6T175D能夠明顯提高抗逆性。說明MdCIPK6部分通過SOS途徑調(diào)控抗逆性。
　　

5、 4.為了鑒定MdCIPK6基因在蘋果抗逆性（如抗鹽、抗旱和抗冷等）中的功能，進行了蘋果轉(zhuǎn)基因研究，結(jié)果表明，與野生型和反義轉(zhuǎn)基因株系相比，過量表達MdCIPK6和MdCIPK6T175D能夠明顯提高蘋果的抗逆性，表明MdCIPK6是蘋果抗逆性的正調(diào)控因子。
　　 5.為了進一步鑒定MdCIPK6基因在作物中的功能，在番茄中過量表達了MdCIPK6基因，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因番茄在萌發(fā)、幼苗和成苗期的抗逆性均明顯提高，說明MdCIP