葡萄糖醛酸化通路在大黃素肝腎代謝及解毒中的基礎作用.pdf

1、目的：
　　大黃素(Emodin)是大黃、何首烏等多種藥材中的主要有效及毒性成分。大黃素劑量過高或長時間應用會產(chǎn)生肝腎損傷，中醫(yī)通常通過炮制、配伍等手段減輕其毒性作用，但具體機理和理論支撐尚不完善。大黃素在體內(nèi)70％以上代謝被UGT代謝，葡萄糖醛酸化轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucurono syltransferases，UGT）是Ⅱ相代謝中重要的解毒酶，受肝腎中多種轉(zhuǎn)錄因子組成的調(diào)控網(wǎng)絡影響。本文基于轉(zhuǎn)錄組測序考察了大黃素的肝腎代謝機

2、理并探尋其代謝解毒途徑，為大黃、何首烏等中藥的臨床解毒應用提供科學理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.本研究將肝腎組織均質(zhì)化后通過差速離心制得富含代謝酶的肝腎微粒體，以染料木素、霉酚酸、齊多夫定分別作為UGTs、UGT1A9和UGT2B7的底物探針驗證肝腎微粒體的活性。
　　2經(jīng)多元線性回歸分析樣本臨床基線資料，利用R軟件分析影響大黃素肝腎代謝的轉(zhuǎn)錄因子和UGTs并比較肝腎差異。
　　3.通過大黃素在55例肝和36例

3、腎微粒體及重組UGT酶中的代謝計算各UGTs在大黃素肝腎代謝中的貢獻度。利用UGT探針底物表征的酶活性對貢獻度大的關鍵酶進行相關性驗證。
　　4.采用MTT法檢測大黃素和其代謝產(chǎn)物的細胞毒性。利用siRNA敲低HepG2細胞中的UGT2B7，并用熒光定量PCR技術和Western-blot技術驗證轉(zhuǎn)染效果;考察大黃素在siRNA-UGT2B7-HepG2細胞裂解物中的酶代動力學特征及細胞毒性的變化。
　　結果與結論：

4、　　1.肝臟中UGT1A1,UGT1A3,UGT1A4,UGT1A6,UGT1A9,UGT2B4,UGT2B7，UGT2B15和UGT2B17表達豐富;腎臟中UGT1A6，UGT1A9和UGT2B7有豐富的表達。
　　2.重組人UGT酶實驗中UGT1A1，UGT1A7，UGT1A8，UGT1A9，UGT1A10，和UGT2B7均參與了大黃素的代謝。大黃素在肝微粒體中的平均代謝速率是腎微粒體中的1.55倍((V)肝=10.14±0.

5、537nmol/mg/min;(V)腎=6.53±0.208nmol/mg/min)。對大黃素肝代謝貢獻度最大的酶依次是UGT2B7(51.71％)＞UGT1A1(24.39％)＞UGT1A9(13.84％);其代謝速率與UGT1A9和UGT2B7酶活性均成正相關（r UGT1A9=0.4369，P UGT1A9=0.0019;rUGT2B7=0.6384，PUGT2B7＜0.0001）。對大黃素腎臟代謝貢獻度最高的UGT亞型是UGT2

6、B7(50.49％)和UGT1A9(47.87％);其代謝速率與UGT1A9和UGT2B7的酶活性高度相關(rUGT1A9=0.7678,P UGT1A9＜0.0001;r UGT2B7=0.6338,P UGT2B7＜0.0001)。故UGT2B7和UGT1A9是大黃素肝腎代謝中的關鍵酶。
　　3.大黃素在肝腎微粒體中的代謝個體差異很大。肝臟中UGTs表達量差異僅可解釋大黃素代謝個體差異的15.9％，且UGT1A9的表達量與大黃

7、素肝代謝速率呈正相關(P=0.044)。在腎臟中UGT表達量差異可以解釋57.0％大黃素代謝個體差異。其中轉(zhuǎn)錄因子HNF4α與UGT1A9/2B7表達及大黃素代謝均呈正相關，NF-κB與UGT1A9/2B7表達及大黃素代謝均呈負相關。
　　4.大黃素UGT代謝產(chǎn)物對HepG2細胞毒性弱于大黃素。siRNA-UGT2B7-HepG2中UGT2B7的基因和蛋白表達量均顯著降低。大黃素對siRNA-UGT2B7-HepG2的毒性明顯增高