蟾蜍甾烯類成分去乙?；A蟾毒精的Ⅱ相葡萄糖醛酸化代謝研究.pdf

1、目的:本論文選用中藥蟾酥中的重要活性成分去乙酰基華蟾毒精(DACB)進(jìn)行體外葡萄糖醛酸化代謝研究，以闡明其代謝特點(diǎn)，明確代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，揭示主要參與代謝的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸化轉(zhuǎn)移酶(UGTs)單酶亞型，闡明其UGT代謝動力學(xué)及相關(guān)參數(shù)，以及UGT代謝種屬差異，詮釋不同羥基位點(diǎn)對于UGT代謝的影響。
　　方法:(1)體外代謝實驗:運(yùn)用體外肝微粒體孵育法，通過人肝微粒體(Humanliver microsomes，HLM)、人腸

2、微粒體(Human intesstine microsomes，HIM)和14種重組單酶亞型及常用實驗動物肝微粒體(豬PLM、狗DLM、猴MLM、大鼠RtLM、小鼠MsLM、兔RLM、豚鼠TLM)對去乙?；A蟾毒精的代謝進(jìn)行代謝酶歸屬、動力學(xué)模型和表觀動力學(xué)參數(shù)的確定、以及比較代謝種屬差異;(2)利用體外代謝孵育制備代謝產(chǎn)物、天然藥物化學(xué)的分離、純化方法（制備HPLC等）和波譜學(xué)手段(NMR、LC-MS)，鑒定代謝產(chǎn)物學(xué)結(jié)構(gòu)，確定底物代

3、謝位點(diǎn);(3)利用Western Blotting方法，確定12例不同人肝微粒體中參與代謝單酶亞型的表達(dá)量，并與12例人肝微粒體的反應(yīng)速率進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步確定單酶亞型的專屬性。
　　結(jié)果:去乙?；A蟾毒精在人肝微粒體中代謝生成兩個單葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，即DACB-3-O-葡萄糖醛酸化產(chǎn)物(M-1)和DACB-16-O-葡萄糖醛酸化產(chǎn)物(M-2)，由單酶歸屬、抑制實驗結(jié)果可知，M-1由UGT1A4催化代謝生成，專屬性佳;M-2由

4、UGT1A1和UGT1A3催化生成，其中UGT1A3占主導(dǎo)地位。由動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn):M-1在HLM和UGT1A4中的代謝遵循經(jīng)典米氏動力學(xué);M-2在HLM，HIM，UGT1 A3中的代謝遵循底物抑制動力學(xué)，在UGT1A1中的代謝遵循米氏動力學(xué)，并得到了相關(guān)的表觀動力學(xué)參數(shù)(Vmax，Km，Ki和CLint);同時，不同種屬的動物肝微粒體對DACB的代謝分析表明:狗、猴、兔、豚鼠肝微粒體中，M-1的代謝生成較多，根據(jù)動力學(xué)分析結(jié)果，確定猴可

5、作為研究M-1代謝生成的體內(nèi)代謝模型動物;豬、狗、猴、兔肝微粒體中M-2的代謝比較迅速，動力學(xué)分析表明，兔子可以作為研究M-2代謝生成的體內(nèi)代謝實驗?zāi)Ｐ蛣游?。另外運(yùn)用了Western Blotting方法也論證了單酶參與DACB代謝的專屬性。根據(jù)單酶歸屬結(jié)果、動力學(xué)分析、相關(guān)性分析和化學(xué)抑制實驗，可以確定DACB可作為UGTA3和UGT1 A4的探針底物。
　　結(jié)論:本論文首次對去乙酰基華蟾毒精在不同臟器、不同種屬微粒體及單酶亞型