Alpha-防御素(α-Defensin)作為診斷關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染生物標(biāo)記物的研究.pdf

1、研究背景
　　人工關(guān)節(jié)置換假體周圍感染(Periprosthetic joint infcction，PJI)是關(guān)節(jié)置換術(shù)后災(zāi)難性的并發(fā)癥，由于其復(fù)雜性，在臨床上是難以避免的并且常常導(dǎo)致不良的臨床預(yù)后。其治療往往需要2階段的關(guān)節(jié)翻修，這會給患者和醫(yī)療體系帶來更多的經(jīng)濟(jì)壓力和負(fù)擔(dān)，而且據(jù)報(bào)道表明翻修失敗率一直在增加，這最終將導(dǎo)致治療的失敗。如何及時(shí)準(zhǔn)確的診斷假體周圍感染，對于避免診斷假陽性的病例術(shù)中進(jìn)行不必要的2階段翻修和防止在假陰

2、性病例中僅僅進(jìn)行1階段修復(fù)而導(dǎo)致植入物再植失敗都是非常重要的。
　　然而，在大部分患者中，關(guān)節(jié)假體周圍感染的診斷不是顯而易見的，其癥狀常常沒有特異性，部分發(fā)生假體周圍感染的病人沒有明顯的臨床表現(xiàn)，因而其診斷一直是臨床上極具挑戰(zhàn)性的難題。預(yù)防是減少這種災(zāi)難性的并發(fā)癥發(fā)生的首要的也是最好的方法。美國肌肉及骨骼感染學(xué)會(Musculoskeletal Infection Society，MSIS)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了這一臨床診斷上的缺陷所在，并且

3、根據(jù)臨床癥狀表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及組織病理學(xué)提供了關(guān)節(jié)假體周圍感染的定義及診斷標(biāo)準(zhǔn)，但其需要1-2個(gè)主要指標(biāo)或4-6個(gè)次要指標(biāo)，雖然可以用于臨床，但其使用復(fù)雜且耗時(shí)長，不易于早期及時(shí)診斷及發(fā)現(xiàn)。關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染是影響手術(shù)成功的重要因素之一，在第一次進(jìn)行關(guān)節(jié)置換患者人群中，發(fā)生于髓關(guān)節(jié)以及肩關(guān)節(jié)的感染的概率通常情況下不超過1％，發(fā)生于膝關(guān)節(jié)的感染概率一般不超過2％，而發(fā)生于肘關(guān)節(jié)感染率則通常較高，一般約為9％。對于進(jìn)行關(guān)節(jié)翻修的患者，

4、其感染率則遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般患者。這種感染存在一定的致死率，據(jù)報(bào)道因感染而引起的患者的死亡率大概在1.0％～2.7％。診斷的理想方法是尋找一種可單獨(dú)并具有高度檢測敏感性和特異性而且容易掌握及理解的方法。目前，臨床醫(yī)生及科學(xué)家致力于通過檢測關(guān)節(jié)腔液中的生物標(biāo)記物(biomarker)的方法來開發(fā)有效且簡單的診斷關(guān)節(jié)周圍感染的診斷工具。但是目前為止，仍舊沒有一種靈敏度及準(zhǔn)確度均能被臨床所接受的生物標(biāo)記物作為早期診斷的指標(biāo)。
　　防御素(de

5、fensins)是固有免疫系統(tǒng)的一部分，是一種具有抗病毒、細(xì)菌、真菌等微生物的的多肽，其功能主要為可以直接中和入侵的病原微生物。α-防御素(α-defensin)主要存在于分葉核中性粒細(xì)胞及包括單核中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)，在自然殺傷細(xì)胞中也有一定表達(dá)。在分葉核中性粒細(xì)胞中，α-防御素在對被吞噬的病原體氧化應(yīng)激依賴性殺傷作用中發(fā)揮重要作用。而且，α-防御素具有廣譜的抗微生物作用，對多種革蘭陰性及陽性菌均有殺傷作用。其在抗微生物中的重

6、要作用表明，α-防御素在關(guān)節(jié)腔液中的表達(dá)也許可以作為假體周圍感染的診斷生物標(biāo)記物。但是就這一點(diǎn)來說，α-防御素檢測在診斷假體周圍感染時(shí)仍沒有獨(dú)立機(jī)構(gòu)確認(rèn)，并且在不同報(bào)道中其敏感性及準(zhǔn)確度均有一定爭議。
　　目前，假體周圍感染已有大量的體外研究結(jié)果，但體外研究結(jié)果仍舊難以替代體內(nèi)情況，這就要求我們?nèi)ソ⒏咝矣杏玫膭游锬Ｐ停瑢⒏鞣N體外研究成果向臨床轉(zhuǎn)化。為研究α-防御素檢測在診斷假體周圍感染的診斷價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)采用兔制備人工膝關(guān)節(jié)假體

7、置換模型，通過向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射不同濃度的金黃色葡萄球菌，在不同時(shí)間點(diǎn)觀察關(guān)節(jié)感染情況和關(guān)節(jié)腔積液量，確定了建立假體周圍感染的合適菌量及處理時(shí)間。利用上述方法制備關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染的動物模型來檢測α-防御素在診斷中的準(zhǔn)確性和特異性，并且和現(xiàn)有的常用實(shí)驗(yàn)室檢查相比較，特別是白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞百分比(PMN％)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)，從而用于探討α-防御素對假體周圍感染的診斷價(jià)值。
　　由于人工

8、關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染的診斷方法往往存在敏感性或特異性達(dá)不到要求或耗時(shí)較長等各種局限，同時(shí)由于近年來抗生素濫用嚴(yán)重，細(xì)菌在關(guān)節(jié)腔內(nèi)形成生物膜等，給診斷帶來了巨大的困難。α-防御素作為一種重要的抑菌肽，在病原體感染后由分葉核中性粒細(xì)胞及其他多種細(xì)胞分泌到關(guān)節(jié)液里面，然后整合到病原菌細(xì)胞膜上并快速殺死病原菌，從而給免疫系統(tǒng)提供抗菌支持，完成自發(fā)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)這一過程。α-防御素的檢測可能成為一種新的現(xiàn)代分了生物學(xué)手段來攻克這道難關(guān)。

9、r>　　第一部分關(guān)節(jié)置換術(shù)后適合關(guān)節(jié)腔抽液假體周圍感染動物模型的建立
　　目的：目前關(guān)于利用金黃色葡萄球菌構(gòu)建關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染動物模型的研究已經(jīng)有部分報(bào)道，但細(xì)菌的具體用量、感染時(shí)間、產(chǎn)生的關(guān)節(jié)液量、構(gòu)建模型的標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)或臨床應(yīng)用的方向等方面仍舊沒有明確、統(tǒng)一的說明。本研究的目的在于通過優(yōu)化細(xì)菌用量及感染時(shí)問等構(gòu)建模型中的關(guān)鍵因素，建立關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染的模型，尋找在不同實(shí)驗(yàn)條件下的關(guān)節(jié)感染狀態(tài)和滿足關(guān)節(jié)液抽取量等條

10、件的最優(yōu)組合，探討該模型建立的可行性和應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：選取健康中國白兔64只，由同一研究員在兔左膝關(guān)節(jié)處做使用鈦合金螺釘行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，術(shù)后即刻行X線檢查，證實(shí)植入物位置良好。之后隨機(jī)分入對照組和實(shí)驗(yàn)組(共4組，對照組A給予生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組B、C、D分別給予金葡菌液1ml，濃度分別為0.5×104cfu/ml，0.5×105c fu/ml，0.5×106cfu/ml)。之后通過進(jìn)行大體評分、細(xì)菌培養(yǎng)鑒定、死亡率、感染率、關(guān)節(jié)

11、腔穿刺抽液計(jì)量等檢測方法，按照MSIS的診斷標(biāo)準(zhǔn)和感染分級評分進(jìn)行評分并判定感染，驗(yàn)證模型建立的有效性、安全性和穩(wěn)定性。
　　結(jié)果：經(jīng)分組基線齊性檢驗(yàn)，四組之間在實(shí)驗(yàn)動物的體重、年齡、性別比例上沒有明顯的差異。在注射生理鹽水或金黃色葡萄球菌后，通過MRI檢測關(guān)節(jié)腔積液量，以橫徑×長徑的值反應(yīng)關(guān)節(jié)腔積液的量:注射后第一周MRi測量關(guān)節(jié)腔積液量（A組無法檢測到，B組0.57±0.21，C組3.05±0.51，D組3.27±0.38），

12、C組明顯高于B組(p＜0.001)，D組也明顯高于B組(p＜0.001)，但C、D兩組之間沒有明顯差異(p=0.38);注射后第二周MRI測量關(guān)節(jié)腔積液量（A組無法檢測到，B組1.58±0.32，C組6.18±0.66，D組6.25±0.58），C組明顯高于B組(p＜0.001)，D組也明顯高于B組(p＜0.001)，但C、D兩組之間沒有明顯差異(p=0.82)。實(shí)際抽取關(guān)節(jié)腔積液量，注射后第一周抽取關(guān)節(jié)腔積液量（A組難以抽取，B組0.

13、12±0.12ml，C組0.25±0.32ml，D組0.37±0.15ml），C組明顯高于B組(p＜0.001)，D組也明顯高于B組(p＜0.001)，但C、D兩組之間存在邊界性差異(p=0.042);注射后第二周抽取關(guān)節(jié)腔積液量（A組難以抽取，B組0.14±0.22ml，C組0.76±0.11ml，D組0.67±0.11 ml），C組明顯高于B組(p＜0.001)，D組也明顯高于B組(p＜0.001)，但C、D兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p

14、=0.15)。A組未出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動物死亡也未出現(xiàn)假體周圍感染，B、C、D三組感染模型構(gòu)建成功率分別為62.5％，100％，100％。盡管C、D兩組的感染率均為100％，但C組死亡率為0％，而D組死亡率則為18.75％。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在感染后第二周關(guān)節(jié)液量足夠進(jìn)行檢測，且能保證大部分實(shí)驗(yàn)動物存活狀態(tài)良好。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)，家兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.5×105cfu/ml的金黃色葡萄球菌1ml能夠成功構(gòu)建穩(wěn)定的關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍

15、感染動物模型，并且在感染后的兩周可以獲得合適的關(guān)節(jié)腔積液量用于假體周圍感染的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。
　　第二部分 Alpha-防御素在關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染診斷中的價(jià)值
　　目的：本研究通過兔關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染模型探討α-防御素在關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染診斷中的價(jià)值，明確診斷閾值，并與其他診斷指標(biāo)進(jìn)行比較，為α-防御素在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：將90只白兔隨機(jī)分為三組:A組為空白對照組，B組為實(shí)驗(yàn)對照組，

16、C組為術(shù)后感染組。模型制備成功后兩周，耳緣靜脈取血用于白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞百分比、C反應(yīng)蛋白、血沉等常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測。空氣栓塞處死實(shí)驗(yàn)動物后，C組關(guān)節(jié)腔穿刺抽取關(guān)節(jié)液樣本， A、B組穿刺入關(guān)節(jié)腔后注射1ml無菌生理鹽水，灌洗后再抽出以獲取樣本。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測α-防御素在關(guān)節(jié)腔液中的表達(dá)，并分別取關(guān)節(jié)腔積液、關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織、假體周圍炎性肉芽組織和假體螺釘行細(xì)菌培養(yǎng)及檢測，利用ROC曲線和Pearsoncorrelat

17、ion分析來評估α-防御素作為生物標(biāo)記物對關(guān)節(jié)置換后假體周圍感染的診斷價(jià)值。
　　結(jié)果：A、B、C三組每組各30只動物。根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果，C組動物關(guān)節(jié)腔組織細(xì)菌培養(yǎng)可見大量金黃色葡萄球菌生長，A、B兩組培養(yǎng)均為陰性，證明引起感染的為金黃色葡萄球菌，利用MSIS標(biāo)準(zhǔn)判定C組動物假體周圍感染模型建立成功。術(shù)后感染組的白細(xì)胞數(shù)明顯高于實(shí)驗(yàn)對照和空白對照組（A組6.59±1.2×109/L，B組10.15±1.07×109/L，C組11.76

18、±1.55×109/L，P＜0.001），敏感性及特異性分別為96％及67％。中性粒細(xì)胞百分比在三組之間也存在明顯差異（A組41.78±10.45％，B組56.00±11.09％，C組69.17±10.26％，p＜0.001），診斷的敏感性和特異性分別為100％及64％。血沉術(shù)后感染組也明顯高于其他兩組（A組2.94±0.50mm/h，B組13.53±0.91mm/h，C組17.48±2.71mm/h， P＜0.001），診斷的敏感性及

19、特異性分別為82％及67％。CRP在三組之間也存在明顯差異（A組1.67±0.15mg/L，B組1.82±0.15mg/L，C組2.20±0.27mg/L，p＜0.001），診斷的特異性及敏感性分別為82％及87％。α-防御素的檢測結(jié)果在C組中明顯高于另外兩組(A組36.56±0.87ng/μL，B組37.91±1.02 ng/μL，C組59.15±5.64 ng/μL，p＜0.001)。α-防御素在診斷的特異性及敏感性上分別達(dá)到100