Toll樣受體在人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體感染中的作用研究.pdf

1、一、背景和目的: 術(shù)后假體感染是關(guān)節(jié)置換術(shù)后的災難性并發(fā)癥，常引起關(guān)節(jié)的疼痛和病廢，以致手術(shù)完全失敗，需要行翻修術(shù)，個別病例甚至需要截肢，給患者帶來巨大的生理、心理痛苦和經(jīng)濟負擔。假體感染的發(fā)病率約為4-12％，翻修再感染率約為4-16％，仍然是目前臨床最棘手的問題，而且隨著接受人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者的增加，因假體感染而需接受治療的患者也將有增無減。明確假體是否存在感染，對治療方案的確定和治療效果的優(yōu)劣有著關(guān)鍵性的影響，但目前臨床

2、工作中，假體感染的診斷和治療非常困難，尤其是對慢性低度深部假體感染的診斷。 Toll樣受體(Toll—like receptors，TLRs)是一類介導天然免疫的跨膜信號傳遞受體家族，識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen—associated molecular patterns，PAMPs)，是聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫的橋梁。在宿主抗微生物反應中起著重要作用。Toll樣受體首次發(fā)現(xiàn)時被認為是果蠅基因，1997年發(fā)現(xiàn)了第一個與

3、果蠅Toll蛋白同源的人Toll樣受體，也就是現(xiàn)在所說的Toll樣受體4(Toll like receptor4，TLR4)。迄今為止，在哺乳類動物中10種TLRs分子和一種TLR同種體(RP105)TLRs已經(jīng)被鑒定。TLRs屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，在免疫細胞中廣泛表達，如：單核—巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、樹突狀細胞和B細胞。它由3個功能區(qū)組成：胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)由十幾至二十幾個串聯(lián)的富含亮氨酸的重復基序(Leuc

4、ine rich repeats，LRRs)組成，這種結(jié)構(gòu)可以加強蛋白質(zhì)之間的粘附，與病原體及其產(chǎn)物的特異性識別有關(guān)，胞內(nèi)段由Toll同源結(jié)構(gòu)域(Toll homology domain，THD)和分子梭基端長短不同的短尾肽(0-22個氨基酸)組成。TLRs的幾種配體已經(jīng)確認，TLR1，TLR2，TLR6被脂肽如Pam3Cy5激活，TLR3被雙鏈RNA(double—stranded RNA，dsRNA)激活，TLR4被脂多糖(Lipo

5、polysaccharide，LPS)激活，TLR5被鞭毛蛋白激活，TLR7，8被單鏈RNA(single—stranded RNA，ssRNA)激活，TLR9被細菌或病毒的未甲基化的CpGDNA激活。TLRs識別內(nèi)、外源性配體后，啟動炎性應答信號通路，上調(diào)主要組織相容性復合物(Major histocompatibility complex，MHC)和CD80、CD86等共刺激分子(Costimulatory molecules，CM

6、)表達，分泌腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor—α，TNF—α)、白介素6(interieukin6，IL—6)等細胞因子而對機體組織產(chǎn)生保護或損傷作用，TLR4介導細菌LPS引起的的活化和釋放多種前炎癥因子中起重要作用。從被發(fā)現(xiàn)至今，TLRs就一直是免疫學界的研究熱點。TLRs在宿主抗微生物反應中起著重要作用。 眾所周知，關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體感染是難診斷、難治療的細菌在關(guān)節(jié)深部假體表面生物膜內(nèi)感染的疾病。反

7、復或持續(xù)的難以根治的感染作為關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染的特點，它促使我們探討TLRs及其介導的天然免疫在關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染中的作用。我們假定關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染后TLRs在外周血白細胞的表達有變化。鑒于此，我們從以下兩方面進行了研究，初步探討TLRs在關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者中的表達變化：1)TLRs在關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者中的表達；2)TLRs在關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染動物模型中的表達。 二、材料和方法: 1.臨床實驗：TLRs在關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者外周血白細

8、胞中的蛋白表達選取11例因非類風濕性疾病行關(guān)節(jié)置換的患者和同期的10例行關(guān)節(jié)鏡檢測患者，分別于入院時和手術(shù)后第3天早晨空腹抽取肘靜脈血4ml，2ml用ELISA法檢測IL—β，IL—6和TNF—α；另2ml用流式細胞術(shù)對TLRs作外周血白細胞的表達分析。組間同一指標比較采用單因素ANOVA方差分析，同組內(nèi)同一指標術(shù)前術(shù)后變化水平比較采用自身配對t檢驗。 2.動物實驗：TLRs在關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染動物模型外周血白細胞中的蛋白表達為分

9、析關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染下的TLRs表達情況，構(gòu)建了昆明小鼠的簡易右膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后表皮葡萄球菌感染模型。然后將動物實驗分為：A組(假體置換術(shù)后感染組)、B組(假體置換術(shù)后無感染組)、C組(關(guān)節(jié)內(nèi)注射細菌組)和D組(關(guān)節(jié)內(nèi)注射生理鹽水的對照組)。分別于實驗后的第1、3天每組各對8只小鼠眼球取血0.2ml，流式細胞術(shù)對TLRs作外周血白細胞的表達分析；取血后處死并取右膝關(guān)節(jié)及周圍組織3塊作細菌培養(yǎng)，有2塊以上組織出現(xiàn)表皮葡萄球菌陽性，則可判定為陽

10、性，同時記錄各組標本感染例數(shù)。對各組各時相TLRs的表達水平結(jié)果進行統(tǒng)計分析，組間同一指標比較采用單因素ANOVA方差分析，同組內(nèi)同一指標術(shù)前術(shù)后變化水平比較采用自身配對t檢驗。 三、結(jié)果: 1.臨床實驗：TLRs在關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者外周血白細胞中的蛋白表達關(guān)節(jié)置換組患者的術(shù)后IL-1β表達高于術(shù)前，P=0.026，各種TLRs蛋白均主要表達于外周血單核細胞，而在外周血淋巴細胞和中性粒細胞的表達率較低；TLR2、7在關(guān)節(jié)置

11、換組患者術(shù)后外周血單核細胞陽性表達率明顯高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05；而TLR4、9則無統(tǒng)計學差異，P>0.05；關(guān)節(jié)鏡組TLRs術(shù)前術(shù)后組間的陽性表達率無統(tǒng)計學差異，P>0.05。對兩實驗組術(shù)前術(shù)后改變進行ANOVA方差分析，可知TLR2、TLR7、TLR9在關(guān)節(jié)置換組和關(guān)節(jié)鏡組患者術(shù)前術(shù)后外周血單核細胞陽性表達率的差異具統(tǒng)計學意義，P<0.05：而TLR4則無統(tǒng)計學差異，P>0.05。這提示在無感染的情況下，手術(shù)本身的應

12、激和局部損傷不影響TLRs的表達，但假體的植入則上調(diào)外周血對TLR2、TLR7、TLR9的表達。 2.動物實驗：TLRs在關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染動物模型外周血白細胞中的蛋白表達術(shù)后感染組，第一天TLRs的表達除TLR7(P=0.158)外均具有顯著的統(tǒng)計性差異，P<0.05；而第三天和第七天，TLRs的表達均無無統(tǒng)計學意義，P>0.05。這表明小鼠在無假體植入的情況下發(fā)生感染，TLRs在初期均有變化，后快速下降。 綜合臨床和動

13、物實驗的結(jié)果，可認為在無臨床感染的情況下，對照關(guān)節(jié)手術(shù)置入假體和關(guān)節(jié)手術(shù)無置入假體，假體置入下調(diào)TLR2、TLR7、TLR9的表達，但對TLR4的表達改變無統(tǒng)計學意義，在動物感染模型上，假體置入同樣地影響TLR7、TLR9的表達，對TLR2、TLR4無影響。但對比四個實驗組，各TLRs的表達水平比較均有非常顯著的統(tǒng)計學意義，P<0.001。 四、結(jié)論: 臨床實驗證實，在蛋白水平，關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者TLRs表達高于術(shù)前，也高

14、于關(guān)節(jié)鏡組患者，初步提示TLRs及其介導的天然免疫應答在假體植入中具有一定的作用，同時上調(diào)IL—6、IL-1β的表達水平。 動物實驗證實，在蛋白水平，關(guān)節(jié)置換術(shù)后動物TLRs表達高于空白對照組，關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染動物TLRs表達也高于關(guān)節(jié)置換術(shù)后無感染動物，初步提示TLRs及其介導的天然免疫應答在人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體感染中具有一定的作用。 綜上所述，TLRs及其介導的天然免疫應答在人工關(guān)節(jié)假體植入后及假體感染中均具有一定的