基于甘草次酸修飾自組裝膠束遞藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、目前，針對肝癌的臨床治療，化學療法依然占據(jù)著重要的地位。然而，傳統(tǒng)的化學治療藥物在通過全身給藥獲得治療效果的同時，也會因藥物非特異性分布而引發(fā)嚴重的毒副作用，長期應用還有引發(fā)腫瘤細胞多藥耐藥效應，降低療效。納米靶向給藥系統(tǒng)是近年來抗腫瘤藥物遞送領域的研究熱點，它通過載體材料將藥物包裹或分散于納米級的基質當中，選擇性將治療藥物遞送到病灶部位，降低藥物的非特異性分布，在增強藥物療效、降低毒副作用的同時，且具有一定的逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的能力

2、。其中，聚合物自組裝膠束作為納米藥物載體，在改善難溶性藥物的溶解性的同時，可以有效地改善藥物體內組織分布，提高藥物的生物利用度，并實現(xiàn)持續(xù)、緩慢的藥物釋放。在聚合物自組裝膠束的設計中通過化學修飾偶聯(lián)肝靶向配體甘草次酸(GA)可實現(xiàn)藥物的肝主動靶向遞送，提高藥物遞送效率。
　　本論文通過兩種不同的設計策略構建了兩種新型的肝靶向聚合物載體材料，在實現(xiàn)藥物肝主動靶向遞送的同時，并探究了甘草次酸修飾在自組裝載藥膠束遞藥行為中的作用。第一種

3、設計策略以O-羧甲基殼聚糖(OCMC)為水溶性骨架，首先通過偶聯(lián)膽酸(CA)對OCMC進行疏水性修飾獲得兩親性O-羧甲基殼聚糖-膽酸聚合物(CMCA)，然后將甘草次酸(GA)通過其C-3位羥基以丁二酸酐為連接臂偶聯(lián)到聚合物上，并對最終的聚合物進行堿化處理，獲得甘草次酸修飾的羧甲基殼聚糖-膽酸聚合物(GA-CMCA)。以CMCA和GA-CMCA為載體，以槲皮素(QC)為模型藥物制備載藥膠束，研究其理化性質、體外釋藥、體外抗腫瘤活性以及體內

4、藥物動力學特征。另以阿霉素(DOX)為抗腫瘤模型藥物驗證CMCA和GA-CMCA的載藥能力，考察其理化性質、體外攝取、體內藥動學特征、體內組織分布以及體內外抗腫瘤活性，評估所構建聚合物膠束系統(tǒng)的肝靶向遞藥能力和抗腫瘤效果。本論文第二種設計策略以低分子肝素(LMWH)為水溶性骨架材料，首先將甘草次酸通過其C-3位羥基以丁二酸酐為連接臂修飾到氨基化的LMWH骨架上得到甘草次酸修飾的LMWH(LMWH-GA)，進而將水溶性肝靶向小分子乳糖酸(

5、LA)偶聯(lián)到聚合物上獲得雙配體修飾的LMWH(LA-LMWH-GA)。利用GA分子的疏水作用力構建自組裝膠束體系，以DOX為模型藥物，考察水溶性乳糖酸修飾對載藥膠束理化性質、載藥與釋藥、體外攝取、體外抗腫瘤活性、體內藥動學特征以及體內組織分布的影響，并通過對比設計策略一中GA-CMCA的藥物遞送行為，分析并探討甘草次酸修飾在聚合物自組裝藥物遞送系統(tǒng)中的作用，為基于甘草次酸修飾的自組裝遞藥系統(tǒng)設計、提高藥物肝靶向遞送能力提供可借鑒的新思路

6、。
　　本論文的主要研究內容及相關結果概括如下:
　　1.利用鹽酸降解法獲得分子量為17 KDa的OCMC，并以其為水溶性骨架，合成了基于OCMC的兩親性聚合物CMCA和GA-CMCA，核磁共振氫譜、紅外光譜以及X射線衍射驗證其結構，紫外分光光度法測定CMCA中CA的取代度以及GA-CMCA中GA的取代度。采用超聲法制備空白自組裝膠束，透射電鏡(TEM)觀察自組裝膠束形態(tài)，測定粒徑、Zeta電勢以及臨界膠束濃度(CMC)。并

7、通過考察空白膠束的體外細胞毒性初步評估所構建膠束的安全性。結果表明，所合成的CMCA和GA-CMCA聚合物可在水介質中自組裝形成大小均一的球形粒子。CMCA膠束的平均水化粒徑為110～257 nm，荷有恒定的負電荷(～-20mV)，芘熒光探針法測定其CMC值為0.028～0.079 mg/ml。隨著CA取代度的增加，粒徑和CMC均呈現(xiàn)降低的趨勢，但表面Zeta電位無明顯變化。選用CA取代度為8.2％的CMCA進行GA進一步修飾，偶聯(lián)GA

8、后的GA-CMCA空白膠束的粒徑和CMC值有變大的趨勢，表面Zeta電位有所降低。研究選用GA取代度為6.5％的GA-CMCA進行后續(xù)評估?；酋Ａ_丹明B(SRB)實驗結果顯示CMCA和GA-CMCA均具有較低的細胞毒性，僅在高濃度時(＞0.25 mg/ml)，GA-CMCA才顯示出不可忽略的細胞增殖抑制作用。
　　2.以QC為模型藥物一，用改良的超聲-透析法制備載藥膠束。在相同藥物/載體質量比下，GA-CMCA顯示出比CMCA更強

9、的藥物包封能力，所制備的QC/GA-CMCA表現(xiàn)出相對較小的粒徑和粒徑分布。當藥物/載體比為1∶5時， GA-CMCA對QC的包封率和載藥量分別可達56.94％和9.69％，相應QC/GA-CMCA的平均粒徑為185.5 nm，粒徑多系分散系數(shù)PDI為0.130。而CMCA對QC的包封率和載藥量僅為47.03％和8.32％，平均粒徑和PDI分別為211.4 nm和0.171。載藥膠束的體外釋放結果顯示QC/CMCA和QC/GA-CMCA

10、均表現(xiàn)出持續(xù)、緩慢、pH響應型的釋藥行為。當釋放介質pH值由7.4降低到6.5時，兩種載藥膠束的釋放速度和累計藥物釋放量均顯著增加，其中QC/GA-CMCA的釋藥速度和累計釋藥量增加更為顯著。當釋放介質pH值進一步降低到5.7時，QC/CMCA的釋藥速度和累計釋藥量進一步增加，而QC/GA-CMCA膠束則在釋放介質中出現(xiàn)明顯聚集沉淀，而QC也隨著聚合物沉淀而析出，導致了緩慢的無突釋現(xiàn)象的藥物釋放。為探究QC/CMCA和QC/GA-CMC

11、A對環(huán)境pH值降低敏感性差異的原因，研究進一步考察了兩種載藥膠束在不同pH值中的Zeta電位變化，結果表明QC/CMCA和QC/GA-CMCA的Zeta電位均隨著pH值的降低而降低，且QC/GA-CMCAZeta電位值降低的速度要顯著快于QC/CMCA。體外抗腫瘤實驗結果顯示，在HepG2細胞中QC/GA-CMCA膠束顯示出比QC/CMCA和QC溶液更強的細胞毒性和促進細胞凋亡的作用。此外，大鼠體內藥動學研究結果表明，QC/CMCA和Q

12、C/GA-CMCA均可以顯著提高QC在體內的循環(huán)時間，降低藥物清除率，其藥-時曲線下面積AUC0-∞分別為QC溶液組的4.9倍和7.4倍。
　　3.以抗腫瘤藥物DOX為模型藥物二，對CMCA和GA-CMCA的藥物包封和遞送能力進行驗證。采用透析法在不同藥物/載體質量比下制備載藥膠束，CMCA和GA-CMCA的載藥量隨著投藥量的增加而增大，但包封率呈現(xiàn)降低的趨勢，尤其以DOX/CMCA的包封率降低更為明顯。當藥物/載體質量比為3∶1

13、0時，GA-CMCA對DOX的包封率為71.25％，而CMCA對DOX的包封率僅為63.41％，說明GA-CMCA對DOX具有更強的包載能力，表明在載藥膠束的自組裝過程中，GA會以疏水形式參與到疏水內核的形成中，增強膠束內核的作用力，加強對疏水藥物的包封。綜合考慮包封率和載藥量指標，選用藥物/載體質量比為1∶5情況下制備的載藥膠束進行后續(xù)評價，測定兩種載藥膠束平均粒徑均在200 nm左右，且荷有恒定的負電荷(～-17mV)。細胞攝取結果

14、顯示，DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA膠束可以顯著提高DOX在耐藥HepG2/ADR細胞中的攝取，且DOX/GA-CMCA膠束作用更為突出。HepG2/ADR細胞中的競爭抑制實驗結果表明，在大量游離甘草次酸存在的情況下，DOX/GA-CMCA的攝取被顯著抑制，說明DOX/GA-CMCA進入細胞與甘草次酸介導的內吞作用有關。而在HepG2細胞中，兩種載藥膠束的攝取均低于DOX溶液，這也間接表明DOX/CMCA和DOX/GA-CMC

15、A在HepG2/ADR細胞中是通過逆轉多藥耐藥而達到提高DOX在胞內聚集目的的。胞內DOX分布結果揭示孵育游離DOX溶液之后，在HepG2細胞中，DOX可以快速的濃集于細胞核附近，且隨著孵育時間延長熒光顯著增強，而在耐藥HepG2/ADR細胞中則點狀零星的分布于細胞質中，且孵育2h和6h熒光強度并未發(fā)生明顯變化。而HepG2細胞和HepG2/ADR細胞在經(jīng)過DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA膠束孵育后，均在細胞質中看到大量的DOX

16、聚集，且隨著孵育時間的增長逐漸釋放到細胞質中。這說明DOX膠束制劑進入HepG2細胞和HepG2/ADR細胞后均存在緩慢、持久的藥物釋放行為。
　　4.以HepG2和HepG2/ADR為細胞模型，考察了DOX載藥膠束的體外抗腫瘤效果，并探討了DOX載藥膠束逆轉耐藥腫瘤細胞多藥耐藥的能力。結果表明DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA膠束均可以因其疏水內核對DOX的保護作用部分逆轉HepG2/ADR細胞的多藥耐藥性，其多藥耐藥逆轉

17、指數(shù)分別為1.45和1.87。相反，在非耐藥HepG2細胞中，DOX溶液具有最高的細胞增殖抑制作用，而DOX包封于CMCA和GA-CMCA后，其細胞毒性作用有所降低，這與DOX載藥膠束緩慢的胞內釋放有關。
　　5.分別以Wistar大鼠和昆明種小鼠為動物模型，以DOX溶液為對照，考察DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA在體內的藥動學行為和組織分布特征。結果表明DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA均能夠顯著延長DOX在大鼠血

18、液循環(huán)中的時間，且DOX/GA-CMCA的效果更為明顯。靜脈注射DOX/GA-CMCA后的藥-時曲線下面積AUC0-∞是注射DOX/CMCA后AUC0-∞值的3.1倍，且其清除率僅為DOX/CMCA組清除率CL值的1/3。小鼠組織分布結果顯示，DOX/GA-CMCA膠束制劑在肝中的分布要顯著高于DOX溶液組和DOX/CMCA組，且在同時間點DOX/GA-CMCA膠束在肝中的分布明顯高于在其他組織中的分布。定量靶向性分析結果表明，DOX/

19、GA-CMCA膠束具有較強的肝靶向性，以DOX溶液組為對照，其在肝、脾、心、肺、腎中24 h的相對攝取率Re值分別為3.50，1.04，0.18，0.04和0.69，可見經(jīng)過GA-CMCA包載在顯著提高DOX在肝臟部位聚集的同時，可有效減少DOX在非靶器官，尤其是心、肺中的非特異性分布，降低藥物遞送毒副作用，這對提高患者依從性具有重要的臨床意義。
　　6.以H-22肝癌荷瘤小鼠為動物模型，以生理鹽水和DOX溶液為對照研究DOX/C

20、MCA和DOX/GA-CMCA的體內抗腫瘤效果，結果表明，DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA可顯著提高DOX的體內抑瘤效果，其中GA修飾的DOX/GA-CMCA對腫瘤生長的抑制作用更為顯著。此外，空白材料GA-CMCA也顯示出一定的體內抑瘤效果，這與甘草次酸本身的抗腫瘤活性有關。
　　7.與策略一中首先構建兩親性CMCA聚合物從而進一步考察GA修飾對藥物遞送的影響不同的是，策略二中首先利用GA的疏水性進行聚合物的自組裝，并進

21、一步考察水溶性LA修飾對載藥膠束藥物遞送的影響。該研究以分子量為4.5 KDa的LMWH為水溶性骨架，合成了LMWH-GA和LA-LMWH-GA，核磁共振氫譜及紅外光譜驗證其結構，并根據(jù)1HNMR中氫原子歸屬計算LMWH-GA中的GA取代度，元素分析方法確定LA-LMWH-GA中的LA取代度。超聲法制備空白自組裝膠束，TEM觀察其表面形態(tài)，測定粒徑、Zeta電勢以及臨界膠束濃度。結果表明，兩種聚合物均可以在水介質中自組裝成均一的球形，測

22、定LWMH-GA膠束的粒徑為109～204nm，CMC值為0.010～0.057 mg/ml，且荷有明顯的負電荷(～35 mV)。選用GA取代度分別為7.47和8.94的LMWH-GA進行LA修飾獲得LA取代度分別為6.32和4.31的LA-LMWH-GA。與相應的LMWH-GA相比，LA-LMWH-GA的粒徑和CMC值明顯增大，且表面Zeta電位顯著降低(-22～-26 mV)。研究探討了聚合物空白膠束的表觀分子量與聚合物膠束粒徑之間

23、的關系，并發(fā)現(xiàn)凝膠滲透色譜(GPC)測定的空白膠束的表觀分子量隨著膠束粒徑的增大而增大。溶血實驗結果顯示，LMWH-GA的溶血毒性隨著GA取代度的增加而增大，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。而經(jīng)乳糖酸修飾后的LA-LMWH-GA的溶血毒性顯示出一定的下降。在所有實驗濃度下，GA取代度為7.47的LMWH-GA和相應的LA-LMWH-GA的溶血率均不高于5％，故該取代度下的LMWH-GA和LA-LMWH-GA可以安全的應用于注射給藥。此外，SRB實驗

24、結果表明，空白膠束對對HepG2和HepG2/ADR細胞均未產生明顯的細胞毒作用，可以安全的應用于藥物遞送領域。
　　8.以阿霉素為模型藥物，探究LMWH-GA作為藥物載體在肝靶向藥物遞送過程中的特點以及進一步水溶性LA修飾對這種遞送行為的影響。透析法在不同藥物/載體質量比下制備載藥膠束。測定其平均粒徑為77～164 nm，Zeta電位為-17～-29 mV，與空白膠束的粒徑和Zeta電位相比均有所降低。在相同藥物/載體質量比下，

25、LMWH-GA對DOX顯示出比LA-LMWH-GA更強的藥物包載能力。當藥物/載體質量比為3∶10時，LMWH-GA對DOX的包封率可達70.3％，而LA-LMWH-GA對藥物的包載僅為58.44％，表明LA修飾降低了聚合物對疏水性藥物的包封能力。當藥物/載體比為1∶10時，兩種載體材料對DOX的包封率最為接近，因此，在該項研究中，除細胞攝取及細胞毒性實驗需對藥物/載體比特別考察外，其他評估實驗中均采用藥物/載體比為1∶10制備的DOX

26、/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA載藥膠束進行考察。兩種載藥膠束在體外均呈現(xiàn)出緩慢、持久、pH敏感型的藥物釋放行為:在pH=5.0酸性釋放介質中的釋放量顯著高于在pH=7.4釋放介質中的釋放量，這有利于膠束在腫瘤部位發(fā)生細胞毒性作用。細胞攝取實驗結果顯示，DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA可以顯著提高DOX在耐藥細胞HepG2/ADR中的攝取，但雙靶向修飾的DOX/LA-LMWH-GA并未表現(xiàn)出其應有的協(xié)同

27、作用，其攝取量低于DOX/LMWH-GA。競爭抑制結果顯示DOX/LMWH-GA的攝取與甘草次酸介導的內吞有關;而DOX/LA-LMWH-GA既可以通過甘草次酸受體介導進入細胞，又可以通過半乳糖受體介導進入細胞，但甘草次酸受體的作用有所減弱。內吞抑制結果表明DOX/LMWH-GA主要通過小窩蛋白途徑和巨型胞飲途徑兩種方式進入細胞，而在DOX/LA-LMWH-GA的攝取中，這兩種入胞機制的作用均明顯減弱，而這可能是DOX/LA-LMWH-

28、GA攝取率低于DOX/LMWH-GA的原因。此外，為探究材料本身在藥物遞送方面的作用，研究對比考察了1∶10和1∶5兩種藥物/載體比制備的DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA的細胞攝取行為，結果顯示1∶10藥物/載體質量比制備的DOX膠束制劑比1∶5藥物/載體質量比制備的DOX膠束在HepG2和HepG2/ADR兩種細胞中均顯示出更強的被細胞攝取的能力。SRB實驗結果表明DOX包載于LMWH-GA和LA-LMWH-GA中

29、可顯著提高DOX對HepG2/ADR細胞的毒性，且DOX/LMWH-GA的毒性要高于DOX/LA-LMWH-GA。而在HepG2細胞中，游離DOX溶液具有最強的細胞殺傷作用，其在兩種細胞中的毒性差別間接說明DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA是通過逆轉HepG2/ADR細胞多藥耐藥性而增強對其細胞毒性作用的。此外，在較低的實驗考察濃度下，1∶10藥物/載體質量比制備的DOX膠束制劑比1∶5藥物/載體質量比制備的DOX膠束

30、制劑毒性較低，而在較高的濃度下，1∶10藥物/載體質量比制備的DOX膠束制劑則表現(xiàn)出較高的細胞增殖抑制作用。
　　9.Wistar大鼠體內藥代動力學實驗結果表明DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA均能夠提高DOX在體內的穩(wěn)定性，延長DOX在血液循環(huán)中的存留時間，其中DOX/LMWH-GA的效果更為明顯。靜脈注射DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA載藥膠束后的AUC0-∞值分別是注射DOX溶液組的22

31、.3倍和10.8倍，平均滯留時間則分別是DOX溶液組的8.2倍和6.5倍。小鼠體內組織分布實驗結果表明兩種載藥膠束，尤其是DOX/LMWH-GA可以顯著改善DOX在小鼠體內的組織分布，高效的靶向于肝臟，并明顯降低在非靶器官尤其是心臟和肺中的分布，降低毒副作用，其在肝、心臟和肺中24h的相對攝取率Re值分別為3.23、0.10和0.05。而乳糖酸進一步修飾的DOX/LA-LMWH-GA膠束制劑并未體現(xiàn)出更好的肝靶向作用，其在肝臟24 h的

32、相對攝取率Re值僅為DOX/LMWH-GA組的0.59倍，而在脾、心臟和肺中的非特異性分布則高于DOX/LMWH-GA組。這可能與LA水溶性修飾影響藥物包封能力、GA受體介導能力、以及DOX/LA-LMWH-GA較快的血液清除速率有關。
　　綜上所述，本研究通過不同設計策略所構建的兩組新型GA修飾的自組裝膠束遞藥系統(tǒng)均可以有效包載疏水性藥物，且能夠通過主動靶向提高藥物在肝臟部位的聚集，在增強治療效果的同時，減少藥物非特異性分布造成