金黃色葡萄球菌臨床菌株中Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的鑒定與功能研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是人類重要的病原細菌，可引起多種感染性疾病。面對來自宿主和環(huán)境的壓力，金黃色葡萄球菌不斷地進化以提高自身的適應能力，從而抵抗真核宿主的免疫系統(tǒng)及環(huán)境中的殺菌因素。其適應環(huán)境的主要方式之一是通過水平基因轉移獲取可移動遺傳元件如質粒、轉座子及噬菌體之上的毒力和抗生素抗性相關基因。
　　原核生物中成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白(clusteredregularly interspaced short palin

2、dromic repeats[CRISPR]-CRISPR associated proteins[Cas])組成CRISPR-Cas系統(tǒng)，具有特異性靶向入侵核酸的功能，其靶標主要是噬菌體和質粒等可移動元件。目前為止，國外有幾個金黃色葡萄球菌臨床菌株被發(fā)現(xiàn)含有Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)，但沒有相關的功能研究報道。在金黃色葡萄球菌的近親表皮葡萄球菌RP62a中，其Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫功能已經(jīng)得到驗證。此外，有研究發(fā)

3、現(xiàn)一些Ⅰ型和Ⅱ型系統(tǒng)還參與了細菌的生理和毒力調控過程。國內金黃色葡萄球菌臨床菌株中CRISPR-Cas系統(tǒng)的分布情況，其免疫功能及其他生理調節(jié)功能，在本研究之前都未見報道。
　　本論文主要進行了三個方面的工作:
　　首先，我們根據(jù)三個已報道CRISPR-Cas系統(tǒng)的序列設計了針對四個cas基因用于PCR篩選的簡并引物。最終我們從六百多個臨床菌株中得到6個含Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的金黃色葡萄球菌臨床菌株，并隨后對這六

4、個菌送樣進行了全基因組二代重測序。其中5個新篩選菌株與已報道菌株有相似的CRISPR序列，但MLST，spa分型顯示它們在種系發(fā)生上距離較遠。這說明CRISPR-Cas系統(tǒng)可以在菌株間進行水平轉移，而不僅僅通過垂直遺傳的方式進行傳播。在已報道菌株和新發(fā)現(xiàn)的5個MRSA菌株中，CRISPR-Cas系統(tǒng)都與SCCmec鄰近，這提示CRISPR-Cas系統(tǒng)的整合位點可能在基因組上SCCmec插入位置的附近。對CRISPR序列的分析發(fā)現(xiàn)，葡萄球

5、菌中Ⅲ-A型系統(tǒng)的重復序列(repeat)具有高度保守性，而間隔序列(spacer)的同源序列大部分發(fā)現(xiàn)于噬菌體中裂解區(qū)的模板鏈上。此外，對六個菌株的比較發(fā)現(xiàn)，spacer數(shù)量較少的AH1菌株含有比其他五個菌株更多的抗性基因和毒性基因，這也許與CRISPR-Cas系統(tǒng)阻止可移動元件轉移的功能有關。
　　同時，我們在AH1菌株中進行了CRISPR-Cas系統(tǒng)免疫功能與機制的研究。質粒侵染實驗發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌的Ⅲ-A型CRISPR

6、-Cas系統(tǒng)可以阻止含spacer同源序列質粒的轉移，且此過程依賴于靶序列的轉錄。對靶標的識別需要crRNA與靶標RNA的序列互補，其中在crRNA5'端的堿基配對比3'端的更重要。CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫功能還依賴于Cas蛋白，其中核酸內切酶Cas6和Csm各組分參與了此過程。
　　此外，為了研究臨床金黃色葡萄球菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)除免疫之外的功能，我們對AH1，AH3和SH3三個菌及它們的CRISPR序列敲除菌株

7、進行了RNA-seq。高通量測序數(shù)據(jù)顯示，在三個菌株中各自的CRISPR影響了不同基因的表達。其中在AH3菌株中，CRISPR敲除導致了包括氮代謝和毒性相關基因在內的一些基因群的轉錄水平發(fā)生了變化。Real-time PCR的實驗結果確認了毒力基因spa和sspABC及調控因子sarS在轉錄水平的改變。
　　通過以上研究，我們在臨床菌株中確定了金黃色葡萄球菌CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)靶標識別依賴于crRNA與靶R