益氣化瘀解毒方抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移及其機制研究.pdf

1、目的：腸癌轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特征，是醫(yī)學(xué)研究的重大課題，從現(xiàn)有的國際國內(nèi)的研究進(jìn)展來看，腫瘤的轉(zhuǎn)移可能一方面與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)，另一方面與機體的免疫力相關(guān)。本實驗的目的是觀察中醫(yī)藥“益氣化瘀解毒”方對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的影響，并從結(jié)腸癌干細(xì)胞及荷瘤鼠的固有免疫這兩個方面進(jìn)一步探討其可能的機制。
　　方法：⑴選取復(fù)方中的中藥單體，構(gòu)建HPLC方法檢測復(fù)方水煎劑中對應(yīng)物質(zhì)的含量，為中藥的質(zhì)控奠定基礎(chǔ)。⑵檢測多株結(jié)腸癌細(xì)胞株的細(xì)胞表面CD13

2、3和CD44分子，明確其表達(dá)情況。⑶體外分選CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞和CD133和CD44同時低表達(dá)的細(xì)胞，比較其干性和分化標(biāo)志物的核酸水平、細(xì)胞周期的異同、無血清培養(yǎng)條件下的克隆球形成的能力、恢復(fù)血清后的細(xì)胞分化能力、軟瓊脂克隆形成能力;進(jìn)而進(jìn)行體內(nèi)實驗，將分選得到的CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞和CD133和CD44同時低表達(dá)的細(xì)胞分別接種于裸鼠腋下，3周后比較其成瘤能力，同時再次檢測瘤組織內(nèi)細(xì)胞表面的CD44和C

3、D133的表達(dá)情況。⑷使用培養(yǎng)基中直接加藥的方法考查體外“益氣化瘀解毒”方對結(jié)腸癌于細(xì)胞的影響。使用裸鼠脾臟接種結(jié)腸癌細(xì)胞，灌胃“益氣化瘀解毒”方3周后，流式檢測脾臟中結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的比例。⑸“益氣化瘀解毒”方對裸鼠皮下移植瘤的影響，比較中藥干預(yù)3周后的移植瘤的大小和其他一般情況。⑹通過在裸鼠結(jié)腸原位接種相同體積的熒光標(biāo)記的結(jié)腸癌組織塊，比較陰性對照組、“益氣化瘀解毒”方組、5-Fu組及中西醫(yī)結(jié)合組的結(jié)腸癌種植轉(zhuǎn)移的情況。⑺通過在裸鼠

4、脾臟注射相同數(shù)目的熒光標(biāo)記的結(jié)腸癌細(xì)胞，比較陰性對照組、“益氣化瘀解毒”方組、5-Fu組及中西醫(yī)結(jié)合組的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的情況。⑻通過流式細(xì)胞術(shù)分析“益氣化瘀解毒”方對裸鼠外周血和脾臟的固有免疫細(xì)胞(NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)的影響。⑼通過細(xì)胞因子芯片的高通量篩選，比較“益氣化瘀解毒”方干預(yù)3周后對造模裸鼠血漿細(xì)胞因子的影響。⑽通過流式細(xì)胞術(shù)比較使用“益氣化瘀解毒”方干預(yù)后對裸鼠的巨噬細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果：①建立了HPLC方法

5、，在中藥復(fù)方中成功檢測出了尿囊素、毛蕊異黃酮苷、甘草苷、甘草酸，為中藥復(fù)方的質(zhì)控奠定了基礎(chǔ)。②在人結(jié)腸癌細(xì)胞株CaCo-2、HT-29、SW480、SW620、LoVo、HCT-116中，只有HCT-116這株細(xì)胞是具有較高比例的CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞亞群。③體外實驗使用流式分選得到CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞以及CD133和CD44同時低表達(dá)的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)前者中干性標(biāo)志（CD133、ALDH2和Lgr5）也高表達(dá)，

6、而分化指標(biāo)CK20為低表達(dá)(p＜0.05);細(xì)胞周期檢測顯示CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞更多地處于G0/G1期，無血清培養(yǎng)和軟瓊脂培養(yǎng)顯示其有更強的克隆球形成能力，恢復(fù)血清后，其克隆球又能恢復(fù)多形性的貼壁細(xì)胞。體內(nèi)實驗為注射分選得到的不同的亞群細(xì)胞進(jìn)行皮下成瘤實驗，結(jié)果顯示，CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞的皮下成瘤能力更強，注射105和104個細(xì)胞時，100％成瘤，注射103個細(xì)胞仍有4/9只成瘤，比CD133和CD44同

7、時低表達(dá)的細(xì)胞組高出一倍，同時瘤重也較重;另外在瘤組織重新研磨后檢測CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞亞群比例上，注射105組為6.8％±1.8％(v.s.2.6％±0.8％，p＜0.05)，說明了CD133和CD44共同高表達(dá)的細(xì)胞是HCT-116細(xì)胞株中的腫瘤干細(xì)胞。④體外實驗考查了益氣化瘀解毒方對結(jié)腸癌干細(xì)胞的影響，在培養(yǎng)基中直接加入中藥復(fù)方干預(yù)，CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞亞群比例變化不大，體內(nèi)實驗造模脾臟注射結(jié)腸癌細(xì)

8、胞肝轉(zhuǎn)移的模型，對復(fù)方中藥灌胃后的脾臟原位瘤的CD133和CD44同時高表達(dá)的細(xì)胞亞群比例改變影響有限（14.97％±8.08％ v.s.13.75％±6.93％，p=0.790）。⑤在皮下移植瘤模型中，益氣化瘀解毒方干預(yù)3周后，與陰性對照組、5-Fu對照組及中藥小劑量聯(lián)合5-Fu組相比，中藥的大、小劑量組的裸鼠體重沒有明顯變化(p＞0.05)，皮下移植瘤的重量雖有下降，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。⑥使用在裸鼠結(jié)腸組織原位移植熒光

9、標(biāo)記的結(jié)腸癌組織的方法，觀察益氣化瘀解毒方干預(yù)3周后的效果，其種植轉(zhuǎn)移率分別為:陰性對照組33.3％，5-Fu對照組28.6％，中藥組0％，中藥聯(lián)用5-Fu組0％，但由于例數(shù)較少，故經(jīng)卡方檢驗，p＞0.05。⑦構(gòu)建脾臟注射熒光標(biāo)記的HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的模型，益氣化瘀解毒方干預(yù)后，其體重各組間無明顯差異，存活率5-Fu組最低(66.7％)，肝轉(zhuǎn)移率為:陰性對照組90.9％（10/11只），5-Fu對照組71.4％（5/7只），

10、中藥組44.4％(4/9只)，中藥聯(lián)用5-Fu組30.0％(3/10只)，與陰性組相比，中藥組和中藥聯(lián)合5-Fu組均具有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。⑧在上述結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的基礎(chǔ)上，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測益氣化瘀解毒方干預(yù)后的裸鼠外周血與脾臟中的NK細(xì)胞活化率、巨噬細(xì)胞含量和中性粒細(xì)胞含量，發(fā)現(xiàn)在外周血的中性粒細(xì)胞占粒細(xì)胞設(shè)門位置里CD45+細(xì)胞的含量方面，益氣化瘀解毒方組明顯高于陰性對照組（77.09％±12.55％ v.s.61.76％

11、±11.51％），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。⑨細(xì)胞因子芯片檢測益氣化瘀解毒方干預(yù)后的裸鼠外周血血漿，發(fā)現(xiàn)GM-CSF、γ-IFN、IL-1a、IL-3、IL-6、IL-13、IL-17水平高于陰性對照組2倍以上。⑩使用無荷瘤裸鼠直接中藥干預(yù)模型，發(fā)現(xiàn)益氣化瘀解毒方干預(yù)2周后，與陰性組相比，脾臟的巨噬細(xì)胞比例明顯增加，2.09％±0.42％ v.s.1.28％±0.26％，p＜0.05。同時發(fā)現(xiàn)拆方的扶正治療組和祛邪治療組與陰性

12、組相比，均不能達(dá)到有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。
　　結(jié)論：益氣化瘀解毒方能通過激活機體的固有免疫系統(tǒng)，尤其是通過增加中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的含量，迅速殺滅游走于血液系統(tǒng)中的脫離原發(fā)灶的結(jié)腸癌細(xì)胞，達(dá)到減少結(jié)腸癌種植轉(zhuǎn)移和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的目的，體現(xiàn)了中醫(yī)理論中“益氣”的指導(dǎo)思想。結(jié)腸癌細(xì)胞中的CD133和CD44同時高表達(dá)細(xì)胞是其腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志，而益氣化瘀解毒方對其影響有限，提示中藥復(fù)方可能不是通過這個途徑達(dá)到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。拆方的研究顯示