益氣化瘀解毒方抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移及其機制研究.pdf

1、目的：腸癌轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學特征，是醫(yī)學研究的重大課題，從現(xiàn)有的國際國內(nèi)的研究進展來看，腫瘤的轉(zhuǎn)移可能一方面與腫瘤干細胞相關，另一方面與機體的免疫力相關。本實驗的目的是觀察中醫(yī)藥“益氣化瘀解毒”方對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的影響，并從結(jié)腸癌干細胞及荷瘤鼠的固有免疫這兩個方面進一步探討其可能的機制。
　　方法：⑴選取復方中的中藥單體，構(gòu)建HPLC方法檢測復方水煎劑中對應物質(zhì)的含量，為中藥的質(zhì)控奠定基礎。⑵檢測多株結(jié)腸癌細胞株的細胞表面CD13

2、3和CD44分子，明確其表達情況。⑶體外分選CD133和CD44同時高表達的細胞和CD133和CD44同時低表達的細胞，比較其干性和分化標志物的核酸水平、細胞周期的異同、無血清培養(yǎng)條件下的克隆球形成的能力、恢復血清后的細胞分化能力、軟瓊脂克隆形成能力;進而進行體內(nèi)實驗，將分選得到的CD133和CD44同時高表達的細胞和CD133和CD44同時低表達的細胞分別接種于裸鼠腋下，3周后比較其成瘤能力，同時再次檢測瘤組織內(nèi)細胞表面的CD44和C

3、D133的表達情況。⑷使用培養(yǎng)基中直接加藥的方法考查體外“益氣化瘀解毒”方對結(jié)腸癌于細胞的影響。使用裸鼠脾臟接種結(jié)腸癌細胞，灌胃“益氣化瘀解毒”方3周后，流式檢測脾臟中結(jié)腸癌腫瘤干細胞的比例。⑸“益氣化瘀解毒”方對裸鼠皮下移植瘤的影響，比較中藥干預3周后的移植瘤的大小和其他一般情況。⑹通過在裸鼠結(jié)腸原位接種相同體積的熒光標記的結(jié)腸癌組織塊，比較陰性對照組、“益氣化瘀解毒”方組、5-Fu組及中西醫(yī)結(jié)合組的結(jié)腸癌種植轉(zhuǎn)移的情況。⑺通過在裸鼠

4、脾臟注射相同數(shù)目的熒光標記的結(jié)腸癌細胞，比較陰性對照組、“益氣化瘀解毒”方組、5-Fu組及中西醫(yī)結(jié)合組的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的情況。⑻通過流式細胞術(shù)分析“益氣化瘀解毒”方對裸鼠外周血和脾臟的固有免疫細胞(NK細胞、巨噬細胞、中性粒細胞)的影響。⑼通過細胞因子芯片的高通量篩選，比較“益氣化瘀解毒”方干預3周后對造模裸鼠血漿細胞因子的影響。⑽通過流式細胞術(shù)比較使用“益氣化瘀解毒”方干預后對裸鼠的巨噬細胞的影響。
　　結(jié)果：①建立了HPLC方法

5、，在中藥復方中成功檢測出了尿囊素、毛蕊異黃酮苷、甘草苷、甘草酸，為中藥復方的質(zhì)控奠定了基礎。②在人結(jié)腸癌細胞株CaCo-2、HT-29、SW480、SW620、LoVo、HCT-116中，只有HCT-116這株細胞是具有較高比例的CD133和CD44同時高表達的細胞亞群。③體外實驗使用流式分選得到CD133和CD44同時高表達的細胞以及CD133和CD44同時低表達的細胞，發(fā)現(xiàn)前者中干性標志（CD133、ALDH2和Lgr5）也高表達，

6、而分化指標CK20為低表達(p＜0.05);細胞周期檢測顯示CD133和CD44同時高表達的細胞更多地處于G0/G1期，無血清培養(yǎng)和軟瓊脂培養(yǎng)顯示其有更強的克隆球形成能力，恢復血清后，其克隆球又能恢復多形性的貼壁細胞。體內(nèi)實驗為注射分選得到的不同的亞群細胞進行皮下成瘤實驗，結(jié)果顯示，CD133和CD44同時高表達的細胞的皮下成瘤能力更強，注射105和104個細胞時，100％成瘤，注射103個細胞仍有4/9只成瘤，比CD133和CD44同

7、時低表達的細胞組高出一倍，同時瘤重也較重;另外在瘤組織重新研磨后檢測CD133和CD44同時高表達的細胞亞群比例上，注射105組為6.8％±1.8％(v.s.2.6％±0.8％，p＜0.05)，說明了CD133和CD44共同高表達的細胞是HCT-116細胞株中的腫瘤干細胞。④體外實驗考查了益氣化瘀解毒方對結(jié)腸癌干細胞的影響，在培養(yǎng)基中直接加入中藥復方干預，CD133和CD44同時高表達的細胞亞群比例變化不大，體內(nèi)實驗造模脾臟注射結(jié)腸癌細

8、胞肝轉(zhuǎn)移的模型，對復方中藥灌胃后的脾臟原位瘤的CD133和CD44同時高表達的細胞亞群比例改變影響有限（14.97％±8.08％ v.s.13.75％±6.93％，p=0.790）。⑤在皮下移植瘤模型中，益氣化瘀解毒方干預3周后，與陰性對照組、5-Fu對照組及中藥小劑量聯(lián)合5-Fu組相比，中藥的大、小劑量組的裸鼠體重沒有明顯變化(p＞0.05)，皮下移植瘤的重量雖有下降，但沒有統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。⑥使用在裸鼠結(jié)腸組織原位移植熒光

9、標記的結(jié)腸癌組織的方法，觀察益氣化瘀解毒方干預3周后的效果，其種植轉(zhuǎn)移率分別為:陰性對照組33.3％，5-Fu對照組28.6％，中藥組0％，中藥聯(lián)用5-Fu組0％，但由于例數(shù)較少，故經(jīng)卡方檢驗，p＞0.05。⑦構(gòu)建脾臟注射熒光標記的HCT-116結(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移的模型，益氣化瘀解毒方干預后，其體重各組間無明顯差異，存活率5-Fu組最低(66.7％)，肝轉(zhuǎn)移率為:陰性對照組90.9％（10/11只），5-Fu對照組71.4％（5/7只），

10、中藥組44.4％(4/9只)，中藥聯(lián)用5-Fu組30.0％(3/10只)，與陰性組相比，中藥組和中藥聯(lián)合5-Fu組均具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。⑧在上述結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的基礎上，使用流式細胞術(shù)檢測益氣化瘀解毒方干預后的裸鼠外周血與脾臟中的NK細胞活化率、巨噬細胞含量和中性粒細胞含量，發(fā)現(xiàn)在外周血的中性粒細胞占粒細胞設門位置里CD45+細胞的含量方面，益氣化瘀解毒方組明顯高于陰性對照組（77.09％±12.55％ v.s.61.76％

11、±11.51％），差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。⑨細胞因子芯片檢測益氣化瘀解毒方干預后的裸鼠外周血血漿，發(fā)現(xiàn)GM-CSF、γ-IFN、IL-1a、IL-3、IL-6、IL-13、IL-17水平高于陰性對照組2倍以上。⑩使用無荷瘤裸鼠直接中藥干預模型，發(fā)現(xiàn)益氣化瘀解毒方干預2周后，與陰性組相比，脾臟的巨噬細胞比例明顯增加，2.09％±0.42％ v.s.1.28％±0.26％，p＜0.05。同時發(fā)現(xiàn)拆方的扶正治療組和祛邪治療組與陰性

12、組相比，均不能達到有統(tǒng)計學意義的差異。
　　結(jié)論：益氣化瘀解毒方能通過激活機體的固有免疫系統(tǒng)，尤其是通過增加中性粒細胞和巨噬細胞的含量，迅速殺滅游走于血液系統(tǒng)中的脫離原發(fā)灶的結(jié)腸癌細胞，達到減少結(jié)腸癌種植轉(zhuǎn)移和結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的目的，體現(xiàn)了中醫(yī)理論中“益氣”的指導思想。結(jié)腸癌細胞中的CD133和CD44同時高表達細胞是其腫瘤干細胞的標志，而益氣化瘀解毒方對其影響有限，提示中藥復方可能不是通過這個途徑達到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。拆方的研究顯示