lncRNA BANCR在肝癌中的生物學作用及對相關信號通路的影響.pdf

1、目的：⑴研究BANCR在肝癌組織及肝癌細胞中的表達及意義；⑵觀察BANCR對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響；⑶觀察肝癌細胞中BANCR與MEK/MAPK信號通路的相關性；⑷觀察BANCR對裸鼠皮下成瘤的影響;研究BANCR對腫瘤組織中凋亡相關蛋白Bcl-2、cleaved caspase-3的影響;探討B(tài)ANCR對腫瘤組織中MEK、P38MAPK信號通路的影響。
　　方法：①Real-time PCR檢測肝癌組織及其對應的癌

2、周正常組織中BANCR mRNA表達，然后檢測肝癌細胞株HepG2、Hep3B、Huh7、SMMC7721及正常人肝細胞株L02中BANCR mRNA表達，之后應用慢病毒載體介導的方法干擾BANCR的表達，驗證干擾效率。②MTT細胞增殖實驗法、克隆形成實驗、流式細胞術、AnnexinⅤ/PI染色、Hoechst33342染色、劃痕實驗、Transwell小室實驗（Matrigel基質膠）及western blot檢測干擾BANCR表達后

3、對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響。③Western-blot觀察BANCR對MEK、MAPK信號通路的影響。④裸鼠皮下成瘤實驗中檢測BANCR對腫瘤形成的影響。
　　結果：⑴分別與癌旁正常肝組織和人肝臟細胞相比，BANCR在肝癌組織和肝癌細胞上均存在高表達。⑵MTT細胞增殖實驗結果顯示:在Huh7細胞和HepG2細胞中，轉染shRNA-BANCR后24h，48h，72h和96h細胞增殖率與轉染shRNA-NC組細胞比較明顯降

4、低，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。⑶克隆形成實驗結果顯示:Huh7細胞:shRNA-BANCR組細胞克隆形成率為21.78±3.15％，shRNA-NC組細胞克隆形成率為36.78±4.03％，與NC組相比，shRNA-BANCR組細胞克隆形成率降低，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。HepG2細胞，shRNA-BANCR組中細胞克隆形成率為19.44±2.59％，shRNA-NC組中細胞克隆形成率為38.56±3.91％，與NC

5、組相比，shRNA-BANCR組細胞克隆形成率降低，差異有顯著性(p＜0.01)。⑷流式細胞術檢測細胞周期結果顯示:Huh7細胞中，shRNA-BANCR組細胞中G0/G1期細胞比例為73.60±5.11％，NC組中G0/G1期細胞比例為54.47±5.62％，與NC組比較，shRNA-BANCR組細胞中G0/G1期細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。HepG2細胞中，shRNA-BANCR組細胞G0/G1期細胞比例為79.

6、33±3.29％，NC組中G0/G1期細胞比例為56.23±5.65％，與NC組比較，shRNA-BANCR組細胞中G0/G1期細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。⑸AnnexinⅤ/PI染色結果顯示:在Huh7細胞，shRNA-BANCR組細胞凋亡率為23.51±1.95％，NC組細胞凋亡率為4.53±0.23％，兩組比較，shRNA-BANCR組細胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。在HepG2細胞中，sh

7、RNA-BANCR組凋亡率為22.79±1.70％，NC組細胞凋亡率為1.61±0.20％，兩組比較，shRNA-BANCR組細胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。⑹Hoechst33342染色結果所示:熒光顯微鏡下觀察:NC組細胞染色后細胞核顯示為顏色分布均勻的弱藍色熒光，shRNA-BANCR組細胞染色后細胞核多呈現亮藍色熒光，可見典型凋亡小體，與NC組比較，shRNA-BANCR組中細胞核呈弱藍色熒光的數量減少，呈亮

8、藍色熒光的凋亡細胞核數量增加。⑺Western-blot結果顯示:在Huh7細胞，BANCR表達下調顯著增加促凋亡蛋白Bax(P＜0.001)、Cleaved caspase-3(P＜0.001)的蛋白表達，降低抑制凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(P＜0.001)，提高Bax/Bcl-2之間的比例。在HepG2細胞中，BANCR表達下調顯著增加促凋亡蛋白Bax(P＜0.01)、Cleaved caspase-3(P＜0.001)的蛋白表達，

9、降低抑制凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(P＜0.001)，提高Bax/Bcl-2之間的比例。⑻劃痕實驗檢測結果顯示:Huh7細胞:shRNA-BANCR組細胞12h的遷移率為10.64±1.62％，NC組細胞12h的遷移率為20.77±3.15％，與NC組相比，shRNA-BANCR組細胞遷移率降低，差異有顯著性(P＜0.01);shRNA-BANCR組細胞24h的遷移率為28.97±3.24％，NC組細胞24h的遷移率為46.42±5.8

10、5％，與NC組相比，shRNA-BANCR組細胞遷移率降低，差異有顯著性(P＜0.01)。HepG2細胞:shRNA-BANCR組細胞12h的遷移率為18.85±2.16％，NC組細胞12h的遷移率為36.33±4.50％，與NC組相比，shRNA-BANCR組細胞遷移率降低，差異有顯著性(P＜0.01);shRNA-BANCR組細胞24h的遷移率為31.95±5.11％，NC組細胞24h的遷移率為64.30±7.29％，與NC組相比，

11、shRNA-BANCR組細胞遷移率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。⑼Transwell檢測結果顯示:觀察穿過微孔膜細胞的數目:Huh7細胞中:shRNA-BANCR組細胞為36.40±4.22個，NC組細胞為62.00±6.89個，與NC組相比，shRNA-BANCR組細胞穿過微孔膜細胞的數目減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。HepG2細胞:shRNA-BANCR組細胞為50.00±5.70個，NC組細胞為66.40±6.

12、19個，兩組比較，shRNA-BANCR組細胞穿過微孔膜細胞的數目減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。⑽Western blot檢測結果顯示:Huh7細胞:E-cadherin蛋白含量:與NC組比較，shRNA-BANCR組表達增加，有顯著性差異(P＜0.001); vimentin蛋白含量:與NC組比較，shRNA-BANCR組下降，有顯著性差異(P＜0.001)。HepG2細胞:E-cadherin蛋白含量:與NC組比較，shR

13、NA-BANCR組表達增加，有顯著性差異(P＜0.001);vimentin蛋白含量:與NC組比較，shRNA-BANCR組表達下降，有顯著性差異(P＜0.001)。⑾Western blot結果顯示:在Huh7肝癌細胞中，與NC組比較，shRNA-BANCR組中p-MEK(P＜0.001)、p-ERK(P＜0.001)、p-JNK(P＜0.001)蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義，p-P38蛋白表達無明顯差異(P＞0.05)。在He

14、pG2肝癌細胞中，與NC組比較，shRNA-BANCR組中p-MEK(P＜0.05)、p-ERK(P＜0.001)、p-JNK(P＜0.001)蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義，p-P38蛋白表達無明顯差異(P＞0.05)。⑿裸鼠皮下成瘤實驗結果顯示:shRNA-BANCR組腫瘤體積及重量與NC組比較減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Western blot結果顯示:與NC組比較，下調BANCR后裸鼠腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表

15、達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，cleaved caspase-3蛋白表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，p-MEK蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)，p-P38蛋白表達無明顯差異(P＞0.05)。
　　結論：①BANCR在肝癌組織、Huh7和HepG2肝癌細胞中均呈現高表達。②下調BANCR抑制肝癌細胞的增殖、遷移及侵襲，促進其凋亡。③下調BANCR抑制肝癌細胞中MEK/ERK/JNK信號通路