p62調(diào)節(jié)DRibbles中HBsAg含量的初步探討.pdf

1、細(xì)胞自噬是高度保守的細(xì)胞生物學(xué)行為，其分子機(jī)制從酵母細(xì)胞到哺乳動(dòng)物細(xì)胞十分相似。在自噬過程中，待降解的胞漿組分及細(xì)胞器被包裹在具有雙層膜結(jié)構(gòu)自噬小體（autophagy）中，最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)的降解，從而維持細(xì)胞自穩(wěn)。阻斷蛋白酶體降解途徑后，提取腫痛細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，因其中含有殘留的廢蛋白（defective ribosome products，DRips），稱之為DRibbles（DRi

2、psin Blebs）。我們前期實(shí)驗(yàn)證明，DRibbles作為腫瘤抗原載體能被DC攝取并通過交叉提呈途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答，DRibbles是具有潛在價(jià)值的腫瘤疫苗載體。
　　 近來研究發(fā)現(xiàn)，p62作為多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的支架蛋白，能通過C末端泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-associated domains，UBA）與泛素化靶蛋白結(jié)合，并通過LRS（LC3recognition sequence，LRS）結(jié)構(gòu)域與LC3結(jié)合，

3、然后由LC3介導(dǎo)將泛素化靶蛋白包裹入自噬小體，最后自噬小體與溶酶體融合完成蛋白的降解。因此，p62在兩種蛋白降解途徑（蛋白酶體降解途徑和自噬降解途徑）之間發(fā)揮著重要的橋梁作用。
　　 本研究擬構(gòu)建HBsAg、泛素-HBsAg以及p62真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DRibbles并檢測(cè)其中HBsAg含量，探討過表達(dá)p62蛋白能否提高自噬小體中泛素化蛋白（HBsAg）的含量，為優(yōu)化DRibbles腫瘤疫苗提供新

4、的思路。
　　 目的：
　　 探討過表達(dá)p62能否提高自噬小體中泛素化蛋白的水平
　　 方法：
　　 1.構(gòu)建p6A-O”PB-UF-IPWS-HBsAg重組質(zhì)粒和p6A-O”PB-UF-IPWS-Ub-HBsAg重組質(zhì)粒；
　　 2.采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，分3組：①p6A-O”PB-UF-IPWS-HBsAg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；②p6A-O”PB-UF-IPWS-Ub-HBsAg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)

5、染組；③p6A-O”PB-UF-IPWS-Ub-HBsAg與pIRES2-EGFP-p62重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組。萬珂、雷帕霉素和氯化銨處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞并制備細(xì)胞裂解液和DRibbles；
　　 3.ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞裂解液和DRibbles的HBsAg含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建了p6A-O”PB-UF-IPWS-HBsAg和p6A-O”PB-UF-IPWS-Ub-HBsAg重組質(zhì)粒；用以轉(zhuǎn)染HepG2

6、細(xì)胞，并獲得穩(wěn)定表達(dá)株；
　　 2.采用萬珂、雷帕霉素和氯化銨處理p6A-O”PB-UF-IPWS-Ub-HBsAg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，裂解液和DRibbles中HBsAg含量均增高；
　　 3.萬珂、雷帕霉素和氯化銨處理Ub-HBsAg和p62重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DRibbles中HBsAg的含量明顯提高，且高于藥物處理的Ub-HBsAg重組質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染組。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功

7、構(gòu)建HBsAg的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后能有效表達(dá)HBsAg蛋白；
　　 2.成功構(gòu)建Ub-HBsAg的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后仍然能檢測(cè)到HBsAg；抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白酶體降解途徑，HBsAg有所增高；Western Blot檢測(cè)顯示：Ub-HBsAg融合蛋白大部分被裂解為HBsAg，這可能是Ub-HBsAg融合蛋白未能成為“短壽蛋白”的主要原因，為下一步完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了依據(jù)；
　　 3.當(dāng)?shù)鞍酌?/p>