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文檔簡(jiǎn)介
1、近來研究發(fā)現(xiàn),p62作為多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的支架蛋白,能通過C末端泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-associated domains,UBA)與泛素化靶蛋白結(jié)合,并通過LRS(LC3 recognition sequence,LRS)結(jié)構(gòu)域與LC3結(jié)合,然后由LC3介導(dǎo)將泛素化靶蛋白包裹入自噬小體,最后自噬小體與溶酶體融合完成蛋白的降解。因此,p62在兩種蛋白降解途徑(蛋白酶體降解途徑和自噬降解途徑)之間發(fā)揮著重要的橋梁作用。
2、r> 本研究擬構(gòu)建p62蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化細(xì)菌后表達(dá)并純化p62蛋白,為制備抗p62抗體及細(xì)胞內(nèi)p62蛋白的檢測(cè)提供基礎(chǔ)。
目的:構(gòu)建p62蛋白的原核表達(dá)載體,原核表達(dá)并純化p62蛋白。
方法:
1.pET28a(+)-p62質(zhì)粒的構(gòu)建:PCR擴(kuò)增p62蛋白的編碼基因片段,雙酶切后插入pET28a(+)載體,轉(zhuǎn)化細(xì)菌后采用PCR、酶切、DNA序列測(cè)定等方法,鑒定pET28a(+)-p6
3、2質(zhì)粒;
1.將pET28a(+)-p62質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌,誘導(dǎo)p62表達(dá)。通過SDS-PAGE檢測(cè)探討誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度等因素對(duì)p62表達(dá)的影響;
2.運(yùn)用His-Bind樹脂純化p62蛋白并用Western Blot方法進(jìn)行純化鑒定。
結(jié)果:
1.1經(jīng)PCR、酶切、DNA序列測(cè)定等方法證實(shí),成功構(gòu)建了p62蛋白的原核表達(dá)載體-pET28a(+)-p62質(zhì)粒;
2
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