RhoA-ROCK1信號通路在膿毒癥相關性ARDS及肺纖維化中的作用及干預研究.pdf

1、研究背景:
　　急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)在重癥醫(yī)學科中具有很高的死亡率，而引發(fā)ARDS最常見的病因是膿毒癥。由重度膿毒癥引起的ARDS會觸發(fā)炎癥反應及肺纖維化進程。越來越多的基礎實驗和臨床研究提示肺成纖維細胞的增殖分化在ARDS相關性肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有重要的病理意義。然而對ARDS相關性肺纖維化的細胞分子基礎的研究至今為止仍然模糊。ICU中ARDS和ARDS相關性肺纖維化的發(fā)生率及病死率仍居高不下。認識肺纖維化發(fā)病機理

2、并且為減輕纖維化程度提供合適的干預方案，這至關重要。
　　目的:
　　通過觀察小鼠肺纖維化模型及RhoA激酶抑制劑（法舒地爾）干預后肺組織中RhoA/ROCK1通路相關蛋白的表達。探究法舒地爾對肺纖維化(pulmonaryfibrosis，PF)的治療作用及RhoA/ROCK1通路在纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。在細胞水平通過觀察脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)對肺成纖維細胞(MRC-5)RhoA/ROCK1通

3、路活性的影響，并觀察RhoA激酶抑制劑法舒地爾對LPS刺激下MRC-5細胞增殖、分化的作用，進一步探討RhoA/ROCK1通路在MRC-5細胞增殖分化中的作用，進而為ARDS的治療尋求新的思路。
　　研究方法:
　　(1)將90只小鼠，嚴格按照隨機化原則歸為3組;對照組(n=30):肺部氣溶膠給藥套裝給予5mg/kg的生理鹽水，作為對照每日固定時間腹腔注射生理鹽水20mg/kg;脂多糖組(n=30):肺部氣溶膠給藥套裝給予5

4、mg/kg的脂多糖（濃度為1mg/mL），每日固定時間腹腔注射生理鹽水20mg/kg/天;法舒地爾組(n=30):肺部氣溶膠給藥套裝給予5mg/kg的脂多糖（濃度為1mg/mL），同樣每日固定時間腹腔注射法舒地爾20mg/kg/天。分別于模型成功后第三天、一周、二周、四周每組各麻醉處死5只小鼠，摘取雙肺。取左肺放置于潔凈空EP管中備用于Westernblot，檢測第3天肺組織中GTP-RhoA，Rho激酶(ROCK1)，肌球蛋白輕鏈磷酸

5、酶靶亞單位1(Myosin phosphatase target subunit1，MYPT1)，p-MYPT1，α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達;RT-PCR檢測α-SMA的mRNA水平。其中右肺置裝有福爾馬林的小管中，用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察組織結構變化。
　　(2)將MRC-5細胞分為四組:空白對照組，LPS組(LPS:10 ug/mL)，低劑量組（法舒地爾:15 umol/mL+LPS:10 ug/mL）和高劑

6、量組（法舒地爾:30umol/mL+LPS:10 ug/mL），細胞去血清培養(yǎng)24 h。Rho pull-down分析法測定RhoA活性;Westemblot檢測GTP-RhoA，ROCK1，MYPT1， p-MYPT1，α-SMA的表達;RT-PCR檢測α-SMA的mRNA水平;通過CCK-8試劑盒和EDU細胞增殖（細胞成像）試劑盒測定MRC-5細胞的增殖情況。
　　結果:
　　(1)脂多糖組RhoA活性，ROCK1蛋白表

7、達，ROCK1下游底物MYPT1的磷酸化及α-SMA蛋白表達較空白組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。藥物處理組(Fasudil)可顯著降低RhoA活性，ROCK1蛋白表達及ROCK1下游底物MYPT1的磷酸化及α-SMA蛋白表達(P＜0.05)。對照組肺組織的病理學改變不明顯，沒有顯著的纖維化改變，炎性細胞浸潤很少，肺泡間隔無可見增厚。脂多糖組肺組織病理學改變明顯，大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚，肺纖維化改變顯著;法舒

8、地爾組炎性細胞浸潤較少，肺泡間隔稍稍增厚，與脂多糖組相比有輕微的肺纖維化改變。
　　(2) LPS明顯上調肺成纖維細胞RhoA活性和ROCK1蛋白表達(P＜0.05），增加ROCK1下游底物MYPT1的磷酸化(P＜0.05)，誘導α-SMA的表達(P＜0.05）并且提高細胞增殖率（P＜0.05）。法舒地爾(Fasudil，F(xiàn)AS)可以抑制LPS誘導的MRC-5細胞增殖分化，且劑量稍高組法舒地爾的抑制作用更加明顯（高劑量組vs低劑量