Tag Array結核耐藥基因檢測芯片快速診斷一、二線藥物耐藥的可行性研究.pdf

1、1993年，WHO宣布―全球結核緊急狀態(tài)‖，至今結核病仍是全球面臨的最嚴重傳染病威脅。WHO結核病全球報告顯示：2014年，結核病使89萬名男性、48萬名女性和14萬名兒童死亡。2000年以來全球結核病發(fā)病率每年下降1.5％，總共降低了18%。估計2014年全球新發(fā)48萬耐多藥（MDR）結核，其中僅約26%病例得到檢測和報告。盡管結核病控制已取得了明顯進步，但進展還遠不夠，特別是耐藥結核檢測、治療上存在巨大的缺口。有報道對耐藥性結核進行

2、了全國范圍的調研，發(fā)現(xiàn)在3037例初診結核患者和892例已經(jīng)治療的患者中，分別有5.7%和25.6%的患者為耐藥結核。約有四分之一對異煙肼/利福平或兩者均產(chǎn)生耐藥性，約8%的MDR結核患者為廣泛耐藥(XDR)結核。
　　結核耐藥已成為全球范圍內急需解決的科學問題和社會問題，在標準化療方案的可靠性下降、研發(fā)抗結核新藥無顯著進展的背景下，推廣藥敏試驗指導下的個體化化療方案勢在必行。控制耐藥結核的關鍵在于合理使用敏感藥物，但 WHO報告

3、僅3%的耐藥結核患者得到了準確有效的治療。因此，應盡早診斷結核耐藥、及時進行藥敏指導下的個體化治療，以降低獲得性結核耐藥的發(fā)生和原發(fā)性結核耐藥的傳播。常規(guī)結核藥敏試驗方法結果可靠，但耗時2-3個月，期間耐藥結核患者無法得到有效治療。因此快速準確的分子藥敏檢測方法成為結核病耐藥檢測領域的研究熱點。目前，我國絕大部分醫(yī)院因為實驗室條件限制，對于結核耐藥檢測結果需從當?shù)亟Y核病專科醫(yī)院獲取。?？漆t(yī)院一般首先基于結核分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)進行細菌培

4、養(yǎng)，再通過改良羅氏絕對濃度法進行藥敏檢測獲取藥敏結果。因其培養(yǎng)陽性率低、實驗檢測總耗時長（一般30-60天），嚴重影響結核病的個體化診療。一些骨關節(jié)結核患者術后進行經(jīng)驗性4聯(lián)藥物化療，在取得藥敏結果之前就已復發(fā)。隨著結核耐藥基因研究的不斷深入，研發(fā)能應用于廣大綜合臨床醫(yī)院的快速、準確的結核藥敏分子檢測技術已成為焦點。
　　基因芯片是一種二代測序技術。它作為一個集成的分析設備，因可在載體上固定的成千上萬的官能化探針，對目標樣本進行準

5、確、快速、高吞吐量的并行分析，而早已在生物化學和醫(yī)學診斷領域進行應用。對于具有眾多基因位點突變導致不同藥物耐藥的結核分枝桿菌而言，生物芯片技術對其進行快速藥敏檢測具有技術可行性和高通量優(yōu)勢。用基因芯片進行結核耐藥檢測可直接在綜合性醫(yī)院檢驗實驗室完成，并且隨著基因芯片技術的不斷發(fā)展和成熟，制造及檢測成本不斷下降，其已廣泛應用的條件可行性。生物芯片北京工程研究中心研發(fā)的國內第一款結核快速藥敏檢測產(chǎn)品―晶芯?結核分枝桿菌耐藥檢測試劑盒‖，能同

6、時檢測利福平和異煙肼兩種一線藥物的耐藥檢測，并具有很高的靈敏度和特異度。因此，本項目與生物芯片北京工程研究中心合作研發(fā)出基于TagArray平臺的第二代結核分枝桿菌耐藥檢測芯片（Tag Array芯片），同時對8個耐藥基因，22個突變位點，38種突變型進行分析，檢測結核桿菌對RFP/INH/EMB/SM/SLID（AMK、CPM、KM）/FQS等一、二線藥物的耐藥情況。
　　因此，本課題基于生物芯片北京工程研究中心的ARMS-PC

7、R-磁珠TagArray平臺研發(fā) Tag Array結核耐藥基因檢測芯片系統(tǒng)，主要分為兩部分：（1）對不同模板濃度的質粒進行檢測，了解新型結核耐藥檢測芯片檢測靈敏度和特異度；（2）在此基礎上，運用二代芯片對骨關節(jié)結核臨床分離株進行耐藥基因檢測，與結核表型耐藥結果對比分析，評價其特異性、靈敏度、準確性和可行性。
　　方法：
　　1、在北京疾控中心獲取已進行測序的不同突變型的結核桿菌菌株并進行質粒提?。總€菌株樣本只含有一種突變

8、型）共24株。獲取質粒后進行濃度檢測，并將不同質粒分別稀釋成1×103拷貝/μl、1×103拷貝/μl、1×104拷貝/μl、1×105拷貝/μl、1×106拷貝/μl，然后進行多重 PCR擴增并行芯片雜交，分析該芯片檢測系統(tǒng)對樣本檢測的靈敏度和特異度，評估其在臨床實際檢測的可行性及應用前景。
　　2、從重慶市公共醫(yī)療衛(wèi)生救治中心獲取從骨關節(jié)結核患者提取的臨床分離株樣本187株，其中敏感菌50株，各種類型耐藥菌137株（均含有藥敏

9、和測序結果）。設計、優(yōu)化和制備芯片檢測體系，包括引物與標簽篩選，多重PCR擴增體系的構建和優(yōu)化，雜交體系優(yōu)化。然后用二代芯片對187株結核分枝桿菌臨床分離株進行藥敏檢測，對照測序結果和表型藥敏結果進行分析靈敏度、特異度。
　　結果：
　　1、用基因芯片對24種不同突變型的菌株進行檢測，在模板濃度為1×103拷貝/μl及以上的組均顯示出與測序結果一致的突變型，在模板濃度為1×102拷貝/μl的組有29組出現(xiàn)了假陰性結果。

10、>　　2、在126株利福平表型耐藥株中，芯片檢測出119株在rpoB基因出現(xiàn)突變，另有7株未檢測出rpoB基因突變；在利福平表型敏感株中，檢測出9株rpoB基因耐藥位點突變。與表型藥敏結果比較，芯片檢測敏感度為：94.40%；特異度為：86.76%。118株異煙肼表型耐藥株中，芯片檢測出109株耐藥株有相關耐藥基因位點突變，另有9株表型耐藥株未檢測出耐藥基因位點突變；與表型藥敏結果比較，芯片檢測敏感度為：92.37%；特異度為：81.1

11、6%。44株乙胺丁醇表型耐藥株中，芯片檢測出27株在embB306位點上有突變，另有17株表型耐藥株中未檢測到該耐藥位點突變；在乙胺丁醇表型敏感株中，有6株檢測到embB306位點突變。與表型藥敏結果比較，芯片檢測敏感度為：61.36%；特異度為：95.80%。102株喹諾酮類藥物表型耐藥株中，芯片檢測出81株在 gyrA基因上有突變，另有21株表型耐藥株中未檢測到相關基因位點突變；在敏感株中有4株檢測到 gyrA基因突變。與表型藥敏結

12、果比較，芯片檢測敏感度為：79.41%；特異度為：95.29%。112株鏈霉素表型耐藥株中，芯片檢測出101株在相關耐藥基因位點上有突變，另有12株表型耐藥株未檢測出耐藥基因位點突變；與表型藥敏結果比較，芯片檢測敏感度為：90.17%；特異度為：84.00%。SLID（阿米卡星、卷曲霉素、卡那霉素）具有交叉耐藥性，在67株表型耐藥株中，芯片檢測出52株在相關耐藥基因位點上有突變，另有15株表型耐藥株未檢測出耐藥基因位點突變；在表型敏感株

13、中，有11株檢測出rrs1401基因突變。其敏感度為：77.61%，特異度為87.50%。
　　結論：
　　1、通過質粒檢測，Tag Array芯片能夠在模板濃度不低于1×103拷貝/μl的條件下進行快速、準確的耐藥檢測。臨床上大部分樣本能滿足其檢測條件，而個別情況下需要進行結核桿菌培養(yǎng)后再進行檢測。本芯片檢測的樣本的靈敏度較高，具有臨床應用的可行性
　　2、與表型耐藥相比，Tag Array芯片檢測RFP、INH、F