基因芯片技術(shù)臨床應(yīng)用于脊柱結(jié)核耐藥檢測(cè)的可行性研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著近年來(lái)耐藥、耐多藥結(jié)核的不斷蔓延,結(jié)核這個(gè)古老的疾病正日益成為當(dāng)今社會(huì)公共衛(wèi)生安全的巨大威脅。繼1993年WHO宣布“全球結(jié)核病緊急狀態(tài)”后,2009年WHO再次發(fā)布報(bào)告:耐藥、耐多藥結(jié)核正在全球蔓延,中國(guó)在世界22個(gè)耐藥結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家中位列第二,僅次于印度[1]。脊柱結(jié)核是最常見的肺外結(jié)核,隨著耐藥肺結(jié)核疫情的惡化,耐藥脊柱結(jié)核的發(fā)病率勢(shì)必逐漸升高。通過(guò)耐藥檢測(cè)詳細(xì)了解結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteri

2、um Tuberculosis,MTB)的耐藥情況,并以此為依據(jù)指導(dǎo)抗結(jié)核化療方案的制定,對(duì)于脊柱結(jié)核的臨床治療具有重要的意義。傳統(tǒng)的耐藥檢測(cè)手段是基于羅氏培養(yǎng)的藥敏試驗(yàn),其檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)(2～3個(gè)月[10)、陽(yáng)性檢出率低(30.86％[7]),無(wú)法充分滿足臨床應(yīng)用的需要;隨著相關(guān)政策法規(guī)日益規(guī)范化,為防止活性菌株在檢測(cè)操作過(guò)程中可能發(fā)生的污染、泄漏等問題,所有涉及MTB活菌的檢測(cè)均須依托于P3實(shí)驗(yàn)室,高昂的硬件建設(shè)費(fèi)用使結(jié)核藥敏試驗(yàn)在一般

3、綜合醫(yī)院的推廣普及相當(dāng)困難。BACT/ALERT3D是誕生于上世紀(jì)90年代的細(xì)菌自動(dòng)培養(yǎng)分析系統(tǒng),用于結(jié)核耐藥檢測(cè)雖可縮短耗時(shí),但僅能進(jìn)行5種一線藥物的藥敏試驗(yàn)。我科在前期研究中對(duì)上述兩種方法整合改進(jìn),將絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)“嫁接”在BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)之后,在保證了藥敏試驗(yàn)全面性的同時(shí)將檢測(cè)耗時(shí)縮短至平均42天[10];然而在耐藥結(jié)核高發(fā)的今天,42天的檢測(cè)周期依舊可能使患者面臨術(shù)前、術(shù)后無(wú)效化療的危險(xiǎn)?；蛐酒夹g(shù)(DNA

4、 Chip)是一種集快捷、靈敏、簡(jiǎn)便等眾多優(yōu)勢(shì)于一身的檢測(cè)手段,隨著結(jié)核耐藥相關(guān)基因的逐步分析確定,已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者初步研究證實(shí),該技術(shù)用于MTB分離株的異煙肼、利福平耐藥檢測(cè)均有令人滿意的效率和準(zhǔn)確性。此外,基因芯片耐藥檢測(cè)的對(duì)象是MTB的DNA,檢測(cè)本身無(wú)需接觸活菌、生物安全性高,便于推廣應(yīng)用?？傊?基因芯片結(jié)核耐藥檢測(cè)具有良好的臨床應(yīng)用前景。
　　 目的：
　　 前期工作已針對(duì)MTB的BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)

5、與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)開展了大量的對(duì)比研究,初步建立了以“BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)”聯(lián)合“絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)”的改進(jìn)型方法[10]。本研究以上述改進(jìn)型方法為標(biāo)準(zhǔn),將基因芯片的檢測(cè)結(jié)果與之對(duì)比,初步評(píng)價(jià)基因芯片技術(shù)臨床應(yīng)用于脊柱結(jié)核耐藥檢測(cè)的可行性,并為下一步設(shè)計(jì)針對(duì)更多種抗結(jié)核藥物的耐藥檢測(cè)芯片提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 選擇我科2009年3月至2010年3月收治的51例臨床診斷的脊柱結(jié)核患者,收集病灶膿液及

6、干酪樣壞死組織進(jìn)行檢測(cè)。
　　 1.BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)及絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn):臨床標(biāo)本經(jīng)常規(guī)前處理后,接種至專用液體培養(yǎng)基,置于BACT/ALERT3D系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng);報(bào)告為陽(yáng)性者進(jìn)行傳統(tǒng)菌種鑒定,同時(shí)進(jìn)行絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)(包含異煙肼、利福平在內(nèi)的11種抗結(jié)核藥物)。
　　 2.基因芯片菌種鑒定及耐藥檢測(cè):臨床標(biāo)本經(jīng)常規(guī)前處理后,經(jīng)核酸提取、PCR擴(kuò)增后,進(jìn)行基因芯片菌種鑒定;鑒定為結(jié)核分枝桿菌者進(jìn)行基因芯

7、片耐藥檢測(cè)(異煙肼和利福平兩種藥物)。
　　 匯總結(jié)果,以BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)及絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),將基因芯片檢測(cè)的結(jié)果與之對(duì)比,從檢測(cè)耗時(shí)、陽(yáng)性檢出率、耐藥符合率等方面初步評(píng)價(jià)基因芯片用于脊柱結(jié)核耐藥檢測(cè)的臨床可行性。
　　 結(jié)果：
　　 1.BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)及絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)
　　 1.1 BACT/ALERT3D系統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果
　　 共培養(yǎng)標(biāo)本51例,

8、培養(yǎng)陽(yáng)性27例,陰性24例。陽(yáng)性檢出率為52.9％。
　　 1.2菌種鑒定結(jié)果
　　 對(duì)培養(yǎng)為陽(yáng)性的標(biāo)本27例標(biāo)本,以對(duì)PNB(對(duì)硝基苯甲酸)、TCH(噻吩-2-羧酸肼)和L-J(改良羅氏培養(yǎng)基)進(jìn)行菌種鑒定。鑒定結(jié)果:27例均鑒定為MTB,其中人型26例,牛型1例。
　　 1.3絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果
　　 51例中共27例進(jìn)行藥敏試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)7例存在耐藥,耐藥率25.9％(7/27)。
　　 1

9、.4檢測(cè)耗時(shí)
　　 51例中共27例培養(yǎng)為陽(yáng)性并完成藥敏試驗(yàn),單例耗時(shí)介于28～58d,平均42d。
　　 2.基因芯片菌種鑒定及耐藥檢測(cè)
　　 2.1基因芯片分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果
　　 51例標(biāo)本均參加基因芯片菌種鑒定,其中42例鑒定為MTB(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,包括人型、牛型),陽(yáng)性檢出率82.4％。
　　 在3D系統(tǒng)培養(yǎng)報(bào)告陽(yáng)性并鑒定為MTB的27例標(biāo)本中,基因芯片菌種鑒定的結(jié)果與之全數(shù)符合

10、;3D系統(tǒng)培養(yǎng)報(bào)告陰性而未能進(jìn)行菌種鑒定的24例標(biāo)本中,15例由基因芯片菌種鑒定為MTB,另外9例為陰性結(jié)果。
　　 2.2基因芯片結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)結(jié)果
　　 對(duì)菌種鑒定為MTB的42例標(biāo)本進(jìn)行基因芯片耐藥檢測(cè),發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)基因存在突變而判斷為耐藥的標(biāo)本共9例,其余的33例標(biāo)本未檢測(cè)到基因突變而判斷為對(duì)異煙肼及利福平均敏感。
　　 以絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),異煙肼耐藥檢測(cè)敏感度為100％、特異度為100

11、％,利福平耐藥檢測(cè)的敏感度為100％、特異度為91.7％?；蛐酒退帣z測(cè)的整體符合率為92.6％。9例耐藥標(biāo)本中有4例發(fā)現(xiàn)于3D系統(tǒng)培養(yǎng)陰性而無(wú)法進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的標(biāo)本中。
　　 2.3檢測(cè)耗時(shí)
　　 共42例標(biāo)本經(jīng)基因芯片菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌并完成耐藥檢測(cè),單例耗時(shí)介于18～23 h,平均20 h。
　　 結(jié)論：
　　 1.基于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的藥敏試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率低、耗時(shí)長(zhǎng)、生物安全性較差、對(duì)實(shí)驗(yàn)條