以斑馬魚為模式動物發(fā)現(xiàn)椎間盤重度受損引起椎骨退變.pdf

1、頸椎病是困擾口腔醫(yī)生的一種常見慢性疾病。研究表明，頸椎病發(fā)生的主要原因是以椎間盤退變?yōu)榛A的頸椎退行性變。椎間盤退變構成大多數(shù)脊椎肌肉骨骼疾病的病理基礎，包括退行性椎管狹窄，椎間不穩(wěn)，頸椎綜合征等。骨質疏松與椎間盤退變存在一定的相關性，骨質疏松會引發(fā)甚至加重椎間盤退變。但是椎間盤與椎骨的發(fā)生發(fā)育、退變和再生修復是一個復雜過程，確切分子生物學機制尚不明確。因此，對于椎間盤與椎骨的退變機制與自我修復機理的深入研究可為椎間盤退行性疾病與椎骨退

2、變的預防和治療提供理論指導。
　　目的：利用斑馬魚這類新型模式動物來構建椎間盤損傷模型，探討椎間盤重度損傷模型應用于椎間盤退行性疾病的研究，為深入探究椎間盤退變與椎骨退變的分子調控機制奠定基礎。
　　方法：通過分子克隆的生物學技術手段構建重組質粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR，借助顯微注射的方式將0.15ng經純化過的重組質粒注射到單細胞期的胚胎的動物極，經過三代連續(xù)傳代，我們培養(yǎng)出穩(wěn)定的

3、斑馬魚 Tg(twhh:Dendra2-NTR)轉基因魚系。利用Mtz/NTR系統(tǒng)對斑馬魚椎間盤的重度損傷來模擬椎間盤退變，組織切片HE染色觀察椎間盤與椎骨組織形態(tài)學的改變、TUNEL實驗揭示椎間盤細胞凋亡的特點，Micro CT掃描來評估椎體骨組織的微觀結構差異、原位雜交檢測椎體中成骨細胞與破骨細胞相關基因的表達變化。
　　結果：通過分子克隆的生物學技術手段成功構建重組質粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra

4、2-NTR。利用顯微注射的方式培育出穩(wěn)定的斑馬魚 Tg(twhh:Dendra2-NTR)轉基因魚系。借助激光共聚焦顯微鏡掃描 Tg(twhh:Dendra2-NTR)轉基因魚揭示斑馬魚椎間盤發(fā)育過程：在幼魚早期綠色熒光細胞標記脊索細胞和底板細胞，茜素紅染色的紅色椎骨礦化是呈環(huán)形椎體的形式，從脊索的頭部向尾部逐漸發(fā)育的；在斑馬魚青年期綠色熒光細胞標記椎間盤內的纖維環(huán)和髓核細胞，茜素紅染色的紅色椎骨礦化開始向前后端和背腹側擴展，每個礦化的

5、脊椎由椎體，神經弓，血管弓三個部分組成，神經弓和血管弓都處于椎骨體的前側邊緣；在斑馬魚成年期綠色熒光細胞特異性的標記椎間盤纖維環(huán)細胞，茜素紅染色的紅色椎骨發(fā)育完全成熟，將綠色標記的椎間盤鑲嵌在其內部，脊柱呈現(xiàn)明顯分段模式。利用激光共聚焦顯微鏡掃描顯示重度損傷的椎間盤綠色熒光細胞無法自我修復，茜素紅染色的紅色椎骨緊密相連、礦化障礙等椎骨退變的病理表型。脊柱組織切片的HE染色揭示椎間盤與椎骨組織的細胞形態(tài)方面的退變；椎間盤的細胞結構發(fā)生明顯