腸道病毒感染后嬰幼兒咽部菌群分析.pdf

1、背景：上呼吸道感染（upper respiratory tract infection，URTI）是兒童的常見病、多發(fā)病，多由病毒感染引起，細(xì)菌感染常繼發(fā)于其后，機(jī)制不明。腸道病毒（Enterovirus，EV）是引起URTI最常見的病原體之一，流行于春末、夏季和秋初。輕者可引起普通感冒、皰疹性咽峽炎和手足口病（hand foot and mouth disease，HFMD）等，重者甚至能導(dǎo)致急性心力衰竭、重癥肺炎、急性遲緩性脊髓炎和

2、敗血癥等。由于目前尚沒有有效的抗病毒藥物和疫苗，每年大范圍的流行給各國家和地區(qū)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，尋找一種有效的預(yù)防或治療EV感染的方法具有重要意義。
　　呼吸道定植著大量細(xì)菌，在長期與人類共同進(jìn)化的過程中，這些細(xì)菌與宿主機(jī)體形成了一個(gè)互利共生的狀態(tài)。它們被稱為正常菌群，參與宿主抵御感染、營養(yǎng)獲得、免疫成熟和神經(jīng)調(diào)節(jié)等過程。大量研究表明，腸道微生物菌群在病毒入侵時(shí)可能發(fā)揮雙重作用，即促進(jìn)或者抵御病毒感染，運(yùn)用宏基因組學(xué)方法

3、篩選得到的一種或者若干種細(xì)菌可作為益生菌治療疾病或者改善癥狀。然而，當(dāng)EV入侵時(shí)，呼吸道菌群承擔(dān)著怎樣的角色尚屬未知，我們擬運(yùn)用16S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)EV感染后的嬰幼兒咽部菌群進(jìn)行分析，以揭示EV與上呼吸道菌群的相互作用，闡明其致病機(jī)制為EV感染的治療提供新思路。
　　方法：1.在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科門診隨機(jī)收集符合入組條件的患兒的臨床資料和口咽拭子，入組條件為：1）由兒科主治醫(yī)師診斷為URTI；2）1月內(nèi)未服用抗生素、益

4、生菌和激素等；3）平素體健，1月內(nèi)未患任何感染性疾?。?）自愿參與調(diào)查并簽署知情同意書。在西京醫(yī)院預(yù)防保健科募集正常對(duì)照，其入組條件參照病例組（第一條除外）。運(yùn)用Copan ESWAB標(biāo)本運(yùn)送系統(tǒng)采集樣本，采用Epidata軟件設(shè)計(jì)問卷并錄入臨床資料。2.運(yùn)用Luminex xTAG? RVP FAST試劑盒檢測(cè)呼吸道病毒。3.若EV為陽性，則提取樣本的全基因組DNA，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)，搭載 Illumina Mi

5、seq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，用生物信息學(xué)方法分析數(shù)據(jù)。4.運(yùn)用 SPSS17.0作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用GraphPad Prism5作圖。
　　結(jié)果：1.2015年5-7月期間，本課題共募集到96名URTI患兒和15名健康嬰幼兒。96個(gè)URTI樣本中，79例檢出病毒，病毒檢出率為82.29％，其中EV、EV+其他病毒混合感染、除EV外其他病毒混合感染、副流感病毒2型、副流感病毒3型，冠狀病毒OC43分別占37.50%、11.46%、9.38%、

6、6.25%、5.21%和5.21%。以3歲以下EV感染的嬰幼兒為研究對(duì)象，共24位感染者，平均年齡19.17月，男:女=14:10；15位健康對(duì)照的平均年齡為19.27月，男:女=10:5。此外，我們還隨機(jī)選取了3名EV+其他病毒混合感染的嬰幼兒和3名年齡大于3歲的兒童的咽拭子進(jìn)行了菌群改變的初步探索。
　　2.Illumina Miseq測(cè)序并對(duì)原始序列處理后，共獲得1,120,649條高質(zhì)量的16S rDNA序列，平均每個(gè)樣品

7、（共45個(gè)樣品）24,903條序列。
　　1）EV感染組較健康對(duì)照組，口咽部菌群多樣性降低，p=0.482，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在門水平，EV感染組梭桿菌門豐度顯著增加，p=0.0098，F(xiàn)DR=0.0098；在屬水平，假單胞菌屬豐度降低，p=0.0293，F(xiàn)DR=0.0293，孿生球菌屬和無類別的纖毛菌屬豐度明顯增加，前者 p=0.0034，F(xiàn)DR=0.0102，后者 p=0.0192，F(xiàn)DR=0.0288。孕周、生產(chǎn)方式、喂養(yǎng)方

8、式、白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比對(duì)腸道病毒感染組樣本的菌群構(gòu)成的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2）EV感染組內(nèi)，無皰疹組較有皰疹組和對(duì)照組，菌群多樣性下降， p值依次是0.0111，0.0392。在物種豐度分析中，有皰疹組和無皰疹組菌群結(jié)構(gòu)在門水平和屬水平均沒有明顯差異。
　　3）混合感染組較 EV感染組菌群多樣性顯著降低，p=0.0020，梭桿菌門相對(duì)豐度降低，p=0.0409，菌群構(gòu)成個(gè)體差異大。
　　4）大于3歲兒童咽