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文檔簡介
1、基于單克隆抗體的生物藥物治療已經(jīng)成為應對威脅人類生命尤其是癌癥等疾病的重要手段。大分子單抗存在組織(如實體瘤)穿透能力差、生產(chǎn)和儲存成本高、價格昂貴等缺點,促使研究人員對抗體分子進行基因工程改造,如小型化(Fab、ScFv以及 Nanobody)或發(fā)展基于新的結(jié)構(gòu)骨架的抗體類似物或模擬物。
納米抗體是存在于駱駝血清中的缺失輕鏈的重鏈抗體可變區(qū)片段,是目前天然來源的具有完全抗原結(jié)合功能的最小抗體分子,具有組織穿透能力強、生產(chǎn)成本
2、低、折疊能力強、易于結(jié)合蛋白裂隙表位以及在極端條件下穩(wěn)定性高等優(yōu)點。這使得納米抗體成為新一代治療性抗體開發(fā)過程中很有希望的候選分子。此外,納米抗體的單域結(jié)構(gòu)特性,使其成為研究抗體結(jié)構(gòu)與功能以及設計新型抗體分子的良好材料。
NBL42為本研究組前期從新疆雙峰駝免疫噬菌體展示文庫中篩選出來的的一個僅具有CDR3和兩側(cè)框架區(qū)的納米抗體。該抗體對溶菌酶具有較高的特異結(jié)合活性和顯著的酶抑制活性。分析該抗體序列,發(fā)現(xiàn)除具有較長的CDR3(
3、17個氨基酸)外,在 FR3序列中有三個氨基酸殘基分別與目前已知的VHH抗體FR3區(qū)相應氨基酸殘基不同,F(xiàn)R4中有一個氨基酸殘基與多數(shù) VHH抗體不同。因此設想能否將該抗體的框架區(qū)作為 CDR3移植的通用骨架。
本研究的目的主要有三個方面:首先,分析NBL42納米抗體結(jié)構(gòu)與抗原結(jié)合活性之間的關系。其次,驗證 NBL42框架區(qū)能否作為CDR3移植肽抗體的通用骨架。最后,采用CDR移植方法制備抗CD47肽抗體,并對其進行活性分析。
4、以期開發(fā)基于駱駝單域抗體的通用小分抗體片段移植架構(gòu),對今后新型抗體的設計提供實驗基礎。
本研究的主要內(nèi)容包括以下三部分:
1.分析 NBL42納米抗體結(jié)構(gòu)與抗原結(jié)合活性之間的關系
首先采用DNA重組技術制備NBL42蛋白。以NBL42-LH的基因為模板, PCR擴增出不含前導區(qū)和鉸鏈區(qū)的NBL42基因片段,構(gòu)建到pET30a表達載體,在大腸桿菌中誘導表達蛋白后再經(jīng)過Ni柱純化,經(jīng)ELISA驗證,去除了前導區(qū)
5、和鉸鏈區(qū)的NBL42納米抗體與溶菌酶仍有較高的結(jié)合能力,非競爭ELISA的方法測得其親和力常數(shù)(Kd)為8.33×10-7 mol/L。測得NBL42的IC50值為14.01μg/mL,顯示其抑菌效果良好,且具有很高的酶抑制活性。NBL42納米抗體在95℃能夠保留64.60%的活性,說明VHH的CDR3衍生而來的抗體可以保留很好的熱穩(wěn)定性和高親和力。
其次通過ELISA實驗,比較了在大腸桿菌不同部位表達的納米抗體抗原結(jié)合活性,
6、結(jié)果顯示,可溶性的NBL42蛋白與包涵體形式復性的蛋白相比,前者有著更好的結(jié)合溶菌酶的活性;包涵體復性的cAb-Lys3仍然具有與細胞周質(zhì)cAb-Lys3同樣的抗原結(jié)合活性。
2.基于NBL42框架區(qū)結(jié)構(gòu)的CDR3移植肽抗體的抗原結(jié)合活性分析
為了確定NBL42抗體的框架區(qū)FR3-FR4作為 CDR3肽抗體移植骨架的可行性,進行以下研究:
首先將NBL42抗體的FR3-FR4區(qū)作為受體,將 VHHA4抗體的
7、CDR3區(qū)作為供體,構(gòu)建 NBL42-A4CDR3重組抗體的DNA片段,將其連接到pET32a表達載體上,對蛋白進行表達純化,ELISA方法檢測其與溶菌酶及蒜氨酸酶的結(jié)合特性。NBL42-A4CDR3重組抗體成功表達,ELISA結(jié)果表明,NBL42-A4CDR3獲得了 VHHA4的部分抗原結(jié)合活性,且與溶菌酶不結(jié)合。原來以包涵體形式表達的VHHA4,在其 CDR3移植到 NBL42的FR3-FR4框架區(qū)之后,獲得了可溶性表達。NBL42
8、和 VHHA4的CDR3具有接近的氨基酸長度,除此之外二者序列上沒有明顯的相似性。
其次選擇cAb-Lys3(結(jié)合溶菌酶,CDR3有19個氨基酸)和鼠單克隆抗體B6H12(結(jié)合CD47,即整合素相關蛋白)作為CDR3序列的供體,選擇NBL42(結(jié)合溶菌酶)的FR3-FR4區(qū)作為CDR3序列的受體。采用全基因合成的方法,合成這兩種CDR3移植肽抗體基因,并構(gòu)建在pET22b(+)表達載體上。Western Blotting結(jié)果表
9、明,兩種肽抗體均在大腸桿菌細胞周質(zhì)中正確表達。但ELISA實驗顯示兩種CDR3移植肽抗體不具備結(jié)合相應抗原的能力。
3.抗CD47肽抗體的制備和活性分析
本研究試圖通過CDR移植的方法,尋找適合與抗原CD47結(jié)合的小分子抗體框架,采用了以下兩種策略設計抗CD47肽抗體:
一是采用文獻報道的具有CDR移植潛力的納米抗體cAbBCII10(結(jié)合β內(nèi)酰胺酶)作為骨架,將單抗B6H12的VHCDR3移植到cAbBC
10、II10的CDR3區(qū)域,構(gòu)建移植抗體cAbBCII10-B6H12H3,原核表達后驗證其與CD47的結(jié)合能力。二是采用Qiu等的方法,直接將B6H12的VHCDR1和VLCDR3通過VHFR2融合在一起,構(gòu)建CDR嵌合抗體B6H12/H1-FR2-L3,原核表達后驗證其與CD47的結(jié)合能力。結(jié)果顯示,兩種移植抗體均能在大腸桿菌中表達。但ELISA實驗表明,cAbBCII10-B6H12和 B6H12/H1-FR2-L3與CD47無特異結(jié)
11、合活性。
本研究系統(tǒng)分析了納米抗體NBL42架區(qū)作為 CDR3通用移植骨架的可能性,在對 VHHA4的CDR3的移植中取得了初步成功,獲得了供體抗體的部分抗原結(jié)合特異性,初步表明NBL42具有作為移植骨架的潛力。但是,采用其他三種來源的抗體移植沒有獲得成功,構(gòu)建的肽抗體沒有預期的抗原結(jié)合活性??赡芘c移植抗體的CDR3來源和氨基酸組成有密切關系。今后還需進一步分析CDR3序列在移植抗體中的作用,為闡明抗體結(jié)構(gòu)與其活性之間的關系提
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