硫化氫通過EGFR-ERK-MMP-2和PTEN-AKT信號通路調控人肝癌細胞生長的作用研究.pdf

1、背景：肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，死亡率極高，主要可分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌，其中原發(fā)性肝癌是肝癌的主要類型。原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）主要由肝臟內的細胞發(fā)生癌變所引起，可分為肝細胞型、膽管細胞型和混合型，其發(fā)病率和死亡率正在逐年增加，其中肝細胞型約占原發(fā)性肝癌中的85.5％。在中國，原發(fā)性肝癌是危害程度最高的惡性腫瘤，每年死于該病的大約為54萬人。因此，對肝癌的預防和治療的研究具有重要的科學意義

2、和臨床價值。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體，近年來的研究表明，H2S能夠在機體內由硫化氫合成酶內源性合成，并且在機體的生理病理過程中發(fā)揮作用，它是機體內繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種氣體信號分子。實驗證明， H2S在腫瘤發(fā)展的生物進程中發(fā)揮著重要的作用。但是，關于H2S對腫瘤的作用還存在爭論，一種觀點認為H2S能夠促進腫瘤細胞的增殖；另一種觀點認為H2S能夠抑制腫瘤細胞的生長。為了澄清

3、這一爭論，本課題將以人肝癌細胞為模型系統(tǒng)的探討H2S對腫瘤的作用。
　　目的：研究硫化氫對人肝癌細胞生長的影響和潛在的作用機制。
　　方法：⑴通過MTT實驗，對人正常肝細胞L02、人肝癌細胞系SMMC-7721和Huh-7細胞給予0μM、10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM的NaHS誘導24h。通過在酶標儀上測定每組細胞的OD值，來檢測硫化氫對細胞的增殖的影響

4、。OD值越大，細胞的增殖水平越高。⑵通過細胞劃痕實驗，對人正常肝細胞L02、人肝癌細胞系SMMC-7721和Huh-7細胞給予0μM、10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM的NaHS誘導24h。分別在0，12，24h時拍照，通過分析劃痕的愈合情況來評估硫化氫對腫瘤細胞遷移的影響。⑶用Western Blot檢測不同濃度NaHS對腫瘤細胞中的Bax、Bcl-2、Caspase

5、-3、Cleaved Caspase-3、AKT、pAKT、ERK、pERK、PTEN、MMP-2、EGF、pEGF蛋白的表達水平的影響。⑷利用TUNEL染色觀察不同濃度 NaHS刺激下人肝癌細胞的凋亡情況。同時進行DAPI染色，便于計算每組細胞的凋亡率。⑸腫瘤模型的建立：將人肝癌細胞（SMMC-7721和 Huh-7）按每只裸鼠注射5×105個細胞，在裸鼠右側腋窩下經(jīng)皮下注射的方式接種。24 h后，成瘤率100%，腫瘤模型建立成功。⑹

6、實驗分組及給藥：造模成功后，將裸鼠按體重進行分組，實驗組分別注射不同濃度NaHS（10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM），陰性對照組注射同等體積的生理鹽水代替NaHS。每天相同時間點由瘤旁注射給藥一次，共給藥14天。整個實驗過程中，每天測量實體瘤的長和寬，用來評估H2S對實體瘤生長的調控。⑺通過腫瘤組織的 HE染色檢測 H2S對實體瘤生長的調控。利用血管新生的標記物CD3

7、4對腫瘤組織進行免疫組織化學染色，觀察不同處理組中腫瘤組織的血管新生情況。⑻通過分析荷瘤裸鼠的體重以及心、肝、脾、肺、腎和腦的重量變化，檢測各組間白細胞的數(shù)量，觀察心、肝、脾、肺、腎和腦組織切片的HE染色來評估H2S荷瘤裸鼠的毒性。
　　結果：①MTT和細胞劃痕實驗結果顯示，0-1000μM的NaHS對正常肝細胞的生長無明顯的影響（P>0.05）；但對人肝癌細胞（SMMC-7721和Huh-7）而言，與陰性對照組相比，10-100

8、μM的NaHS能夠顯著的促進人肝癌細胞的增殖和遷移(P<0.05)，600-1000μM的NaHS對人肝癌細胞的生長和遷移有顯著的抑制作用(P<0.05)。②TUNEL染色和對凋亡蛋白的檢測結果表明，與陰性對照組相比，25-100μM的NaHS可以明顯抑制腫瘤細胞的凋亡(P<0.05)，600-1000μM的NaHS能顯著促進腫瘤細胞的凋亡(P<0.05)。③與陰性對照組相比，Western blot結果顯示，低濃度的H2S可以誘導EG

9、FR、AKT和ERK的磷酸化水平升高（P<0.05），而高濃度的H2S可以抑制EGFR、AKT和ERK的磷酸化（P<0.05）。④所有裸鼠接種人肝癌細胞成功，成瘤率100%，成功建立荷瘤裸鼠模型。⑤腫瘤組織的HE染色結果顯示，與陰性對照相比，10-1000μM的NaHS范圍內，腫瘤組織內的細胞的增殖呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。⑥免疫組織化學結果顯示，與陰性對照組相比，10-100μM NaHS組的微血管密度（microvessel den

10、isity，MVD）明顯升高(P<0.05)。在600-1000μM NaHS組的微血管密度顯著降低(P<0.05)。⑦HE染色結果顯示各組裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等器官無明顯形態(tài)學差異，裸鼠血液中白細胞總數(shù)及心、肝、脾、肺、腎和腦的重量指數(shù)表明各組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　結論：⑴低濃度H2S（25-100μM）對人肝癌細胞有促進其生長和抑制其凋亡的作用。⑵高濃度H2S（600-1000μM）對人肝癌細胞有抑制其生