硫化氫通過(guò)EGFR-ERK-MMP-2和PTEN-AKT信號(hào)通路調(diào)控人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用研究.pdf

1、背景：肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，死亡率極高，主要可分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌，其中原發(fā)性肝癌是肝癌的主要類型。原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）主要由肝臟內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生癌變所引起，可分為肝細(xì)胞型、膽管細(xì)胞型和混合型，其發(fā)病率和死亡率正在逐年增加，其中肝細(xì)胞型約占原發(fā)性肝癌中的85.5％。在中國(guó)，原發(fā)性肝癌是危害程度最高的惡性腫瘤，每年死于該病的大約為54萬(wàn)人。因此，對(duì)肝癌的預(yù)防和治療的研究具有重要的科學(xué)意義

2、和臨床價(jià)值。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體，近年來(lái)的研究表明，H2S能夠在機(jī)體內(nèi)由硫化氫合成酶內(nèi)源性合成，并且在機(jī)體的生理病理過(guò)程中發(fā)揮作用，它是機(jī)體內(nèi)繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種氣體信號(hào)分子。實(shí)驗(yàn)證明， H2S在腫瘤發(fā)展的生物進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。但是，關(guān)于H2S對(duì)腫瘤的作用還存在爭(zhēng)論，一種觀點(diǎn)認(rèn)為H2S能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為H2S能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。為了澄清

3、這一爭(zhēng)論，本課題將以人肝癌細(xì)胞為模型系統(tǒng)的探討H2S對(duì)腫瘤的作用。
　　目的：研究硫化氫對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響和潛在的作用機(jī)制。
　　方法：⑴通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)，對(duì)人正常肝細(xì)胞L02、人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和Huh-7細(xì)胞給予0μM、10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM的NaHS誘導(dǎo)24h。通過(guò)在酶標(biāo)儀上測(cè)定每組細(xì)胞的OD值，來(lái)檢測(cè)硫化氫對(duì)細(xì)胞的增殖的影響

4、。OD值越大，細(xì)胞的增殖水平越高。⑵通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，對(duì)人正常肝細(xì)胞L02、人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和Huh-7細(xì)胞給予0μM、10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM的NaHS誘導(dǎo)24h。分別在0，12，24h時(shí)拍照，通過(guò)分析劃痕的愈合情況來(lái)評(píng)估硫化氫對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響。⑶用Western Blot檢測(cè)不同濃度NaHS對(duì)腫瘤細(xì)胞中的Bax、Bcl-2、Caspase

5、-3、Cleaved Caspase-3、AKT、pAKT、ERK、pERK、PTEN、MMP-2、EGF、pEGF蛋白的表達(dá)水平的影響。⑷利用TUNEL染色觀察不同濃度 NaHS刺激下人肝癌細(xì)胞的凋亡情況。同時(shí)進(jìn)行DAPI染色，便于計(jì)算每組細(xì)胞的凋亡率。⑸腫瘤模型的建立：將人肝癌細(xì)胞（SMMC-7721和 Huh-7）按每只裸鼠注射5×105個(gè)細(xì)胞，在裸鼠右側(cè)腋窩下經(jīng)皮下注射的方式接種。24 h后，成瘤率100%，腫瘤模型建立成功。⑹

6、實(shí)驗(yàn)分組及給藥：造模成功后，將裸鼠按體重進(jìn)行分組，實(shí)驗(yàn)組分別注射不同濃度NaHS（10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM），陰性對(duì)照組注射同等體積的生理鹽水代替NaHS。每天相同時(shí)間點(diǎn)由瘤旁注射給藥一次，共給藥14天。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天測(cè)量實(shí)體瘤的長(zhǎng)和寬，用來(lái)評(píng)估H2S對(duì)實(shí)體瘤生長(zhǎng)的調(diào)控。⑺通過(guò)腫瘤組織的 HE染色檢測(cè) H2S對(duì)實(shí)體瘤生長(zhǎng)的調(diào)控。利用血管新生的標(biāo)記物CD3

7、4對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察不同處理組中腫瘤組織的血管新生情況。⑻通過(guò)分析荷瘤裸鼠的體重以及心、肝、脾、肺、腎和腦的重量變化，檢測(cè)各組間白細(xì)胞的數(shù)量，觀察心、肝、脾、肺、腎和腦組織切片的HE染色來(lái)評(píng)估H2S荷瘤裸鼠的毒性。
　　結(jié)果：①M(fèi)TT和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0-1000μM的NaHS對(duì)正常肝細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯的影響（P>0.05）；但對(duì)人肝癌細(xì)胞（SMMC-7721和Huh-7）而言，與陰性對(duì)照組相比，10-100

8、μM的NaHS能夠顯著的促進(jìn)人肝癌細(xì)胞的增殖和遷移(P<0.05)，600-1000μM的NaHS對(duì)人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移有顯著的抑制作用(P<0.05)。②TUNEL染色和對(duì)凋亡蛋白的檢測(cè)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，25-100μM的NaHS可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡(P<0.05)，600-1000μM的NaHS能顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡(P<0.05)。③與陰性對(duì)照組相比，Western blot結(jié)果顯示，低濃度的H2S可以誘導(dǎo)EG

9、FR、AKT和ERK的磷酸化水平升高（P<0.05），而高濃度的H2S可以抑制EGFR、AKT和ERK的磷酸化（P<0.05）。④所有裸鼠接種人肝癌細(xì)胞成功，成瘤率100%，成功建立荷瘤裸鼠模型。⑤腫瘤組織的HE染色結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，10-1000μM的NaHS范圍內(nèi)，腫瘤組織內(nèi)的細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。⑥免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，10-100μM NaHS組的微血管密度（microvessel den

10、isity，MVD）明顯升高(P<0.05)。在600-1000μM NaHS組的微血管密度顯著降低(P<0.05)。⑦HE染色結(jié)果顯示各組裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等器官無(wú)明顯形態(tài)學(xué)差異，裸鼠血液中白細(xì)胞總數(shù)及心、肝、脾、肺、腎和腦的重量指數(shù)表明各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：⑴低濃度H2S（25-100μM）對(duì)人肝癌細(xì)胞有促進(jìn)其生長(zhǎng)和抑制其凋亡的作用。⑵高濃度H2S（600-1000μM）對(duì)人肝癌細(xì)胞有抑制其生